[发明专利]环孢霉素A半抗原的制备方法及环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒

权利要求书

1.环孢霉素A半抗原的制备方法，步骤如下：

(1)环孢霉素A按质量体积比3g∶1ml比例溶于嘧啶中，再逐滴加入与嘧啶等体积的二氯甲烷，在常温充氩气环境中搅拌过夜；

(2)将步骤(1)的产物真空蒸发干燥得到固体残渣溶于二氯甲烷，溶液过凝胶柱分离纯化，得到二氧化硅化环孢霉素A；

(3)制备一级粗产品：

按质量体积比5g∶1ml将TMS-CsA溶入乙醚中，再按TMS-CsA与甲苯的质量体积比为1g∶30ml加入甲苯和按TMS-CsA与氢化钠质量比2∶1加入氢化钠，在通氩气的条件下常温搅拌30min后冷却到4℃，按TMS-CsA与环氧乙烷的质量体积比为1g∶6ml用注射器加入环氧乙烷，然后将反应器加盖封口，常温搅拌反应24小时后，加入2～3倍反应物体积的水，用1M的HCL酸化，加入4～6倍反应物体积的二氯甲烷混合，分离有机相后，加水洗提，洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到一级粗产品；

(4)于常温、通氩气的条件下，将一级粗产品2份和1，4丁二醇二缩水甘油醚按质量1份溶于甲苯中，一级粗产品与甲苯的质量体积比为1g∶5～10ml，常温搅拌2h后，按一级粗产品与乙酸乙酯质量体积比为1g∶100～200ml加入乙酸乙酯，及与乙酸乙酯等体积的水，分离混合液中有机相，用50％的氯化钠溶液洗提有机相，洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到二级粗产品；

(5)在搅拌状态下，取按二级粗产品与甲醇的质量体积比为1g∶40ml将二级粗产品加入甲醇中，补充水直至混合液有明显雾团，加入与二级粗产品质量比为1∶0.5～1.5的无水碳酸钾，常温通氩气搅拌过夜，用1M盐酸酸化处理，加入与甲醇等体积的水，用二氯甲烷提取有机相，用与甲醇等体积的盐水洗涤有机相后用硫酸镁干燥得到环孢霉素A半抗原。

2.权利要求1的制备方法得到的环孢霉素A半抗原。

3.环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒，包括：抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体或抗抗体包被的酶标板，酶标记的环孢霉素A半抗原；或与载体蛋白偶联的环孢霉素A半抗原包被的酶标板，酶标记的抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体或抗抗体；其特征在于所述用于包被酶标板的环孢霉素A半抗原和酶标记的环孢霉素A半抗原采用权利要求1所述的制备方法获得。

4.根据权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒，所述抗环孢霉素A的特异性单克隆抗体包被的酶标板的包被浓度为：0.10-0.25μg/ml。

5.根据权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒，所述与载体蛋白偶联的环孢霉素A半抗原包被的酶标板的包被浓度为0.15-0.45μg/ml。 

6.根据权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒，所述抗抗体包被的酶标板的包被浓度为：0.15-0.34μg/ml。

7.根据权利要求2所述的酶联免疫检测试剂盒，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、蓝血蛋白或卵清蛋白。

8.根据权利要求3～7任一所述的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒还包括样品前处理液、样品稀释液、环孢霉素A标准品溶液、环孢霉素A质量控制溶液、显色液、终止液、浓缩洗涤液，所述样品前处理液为含20-100mM硫酸锌的甲醇溶液与乙二醇混合液；样品稀释液为含0.3-0.5M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液；环孢霉素A标准品溶液，环孢霉素A质量控制溶液为含有不同浓度环孢霉素A的人全血溶液；所述浓缩洗涤液为pH值7.2～8.5、终浓度为0.02～0.05％Proclin300、1.0～2.0％吐温-20、0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求8所述的酶联免疫检测试剂盒，酶标记所用的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色液由显色A液和显色B液组成，中A液为的组成为：pH值为72～8.5，浓度为10～30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.02～0.1％Proclin300，0.1～1.0％吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02～0.1％Proclin300，1.0～3.0mM的4-碘苯酚，0.1％～1％的BSA，0.1～1％的溴化十六烷基三甲基铵，10～50mM鲁米诺溶液。

10.根据权利要求8所述的酶联免疫检测试剂盒，酶标记所用的标记酶为碱性磷酸酯酶，显色剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。