[发明专利]环孢霉素A半抗原的制备方法及环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测试剂，特别是环孢霉素A半抗原的制备方法及环孢霉素A的酶联免疫定量检测试剂盒。

背景技术

环孢霉素A(cyclosporin A)是一种从真菌中提取，由瑞士山德士药厂1976年首次发现并报告有免疫抑制作用的药物。同年英国剑桥的R.Calne在动物的器官移植上应用取得了令人难忘的结果，并于1978年成功地试用于临床肾脏移植和骨髓移植。环孢霉素A的出现对器官移植的发展起了巨大的推动作用，如今被称之为“器官移植的环孢霉素”，是目前最常用的免疫抑制剂，也用于自身免疫疾病的治疗。其主要作用是通过可选择性地抑制免疫应答，有选择性地抑制活性T细胞增殖依赖的细胞因子IL-2，致使T细胞分化、发育产生障碍，从而保护移植物(器官)免遭T细胞毒性作用的破坏，而对其他的免疫细胞的抑制作用则相对较弱。

在临床上，环孢霉素A的使用剂量、血药浓度与疗效、药物毒性密切相关，在高血浓度时有一定的毒性，主要是神经毒性和肾毒性。因此临床使用需要制定合理的用药方案，经常测定血中环孢霉素A的浓度来监测环孢霉素A的用量是否合适。

据统计，截至2008年，我国移植手术总量已经超过10万次，现在我国已经成为继美国之后的世界第二大器官移植国家，每年器官移植手术已经超过1万例，而且随着经济及医疗水平的发展，以后的器官移植患者会越来越多。环孢霉素A由于具有上市早，药效明显，价格相对低廉的特点，是当前居于市场首位的免疫抑制剂，约占当前免疫抑制剂市场份额的25％。一般移植手术后2月内，病人需要每1-2周检测一次血药浓度，4月内每2-4周检测一次血药浓度，半年以上要每月检测一次血药浓度。

现在国内市场上用于环孢霉素A检测的试剂盒几乎全部依赖进口，生产检测试剂盒的厂家主要有美国Dade Behring公司、美国雅培制药有限公司、德国罗氏集团、西门子医学诊断产品公司，其中用于检测反应的半抗原环孢霉素A都包被为微粒子结构，以适用于配套的分析仪器进行检测，这样就提高了医院及检测中心的准入门槛，对检测实验操作人员要求也比较高，同样附加于病人的诊疗费用也相应提高。而国内实际情况是，人均国民经济水平偏低，器官移植患者对于进口试剂的经济承受能力有限，而且医疗卫生检测机构水平差距非常大，对于很多进口仪器的操作和数据分析，缺乏专业技术人员；而酶标仪已经逐步国产化，相对于进口试剂配套的检测仪器，酶标仪的价格是目前大多数地方医院及检测中心所能接受的，且酶标仪操作简单、便捷，对技术人员要求不高。现在的酶标仪只适合检测包被为板式的抗原板或抗体板，而环孢霉素A本身为小分子药物，属于半抗原，采用现有技术中常用的抗原包被方法，均无法得到灵敏度高、重复性好的适于检测应用的酶标板，因此，首先得克服这一技术困难，才能做成适于国内普遍适用的环孢霉素A检测试剂盒。

发明内容

根据上述领域的空白及需求，本发明提供一种环孢霉素A酶联免疫检测试剂盒，具有高灵敏度和精确度，能满足检测需要，而且操作简单快捷，不需要购买昂贵的分析仪器与之配套检测，不需要特殊的技术人员进行操作，这样可以解决二线、三线城市检测中心的检测需求。

环孢霉素A半抗原的制备方法，步骤如下：

(1)环孢霉素A按质量体积比3g∶1ml比例溶于嘧啶中，再逐滴加入与嘧啶等体积的二氯甲烷，在常温充氩气环境中搅拌过夜；

(2)将步骤(1)的产物真空蒸发干燥得到固体残渣溶于二氯甲烷，溶液过凝胶柱分离纯化，得到二氧化硅化环孢霉素A(TMS-CsA))；

(3)制备一级粗产品：

按质量体积比5g∶1ml将TMS-CsA溶入乙醚中，再按TMS-CsA与甲苯的质量体积比为1g∶30ml加入甲苯和按TMS-CsA与氢化钠质量比2∶1加入氢化钠，在通氩气的条件下常温搅拌30min后冷却到4℃，按TMS-CsA与环氧乙烷的质量体积比为1g∶6ml用注射器加入环氧乙烷，然后将反应器加盖封口，常温搅拌反应24小时后，加入2～3倍反应物体积的水，用1M的HCL酸化，加入4～6倍反应物体积的二氯甲烷混合，分离有机相后，加水洗提，洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到一级粗产品；

(4)于常温、通氩气的条件下，将一级粗产品2份和1，4丁二醇二缩水甘油醚按质量1份溶于甲苯中，一级粗产品与甲苯的质量体积比为1g∶5～10ml，常温搅拌2h后，按一级粗产品与乙酸乙酯质量体积比为1g∶100～200ml加入乙酸乙酯，及与乙酸乙酯等体积的水，分离混合液中有机相，用50％的氯化钠溶液洗提有机相，洗提产物用硫酸镁干燥并过凝胶柱分离纯化得到二级粗产品；