[发明专利]脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因

权利要求书

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示氨基酸序列；和

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计第57位氨基酸残基为Val，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计，(2)所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码权利要求1-2中任一项所述的多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ IDNO：4、6、8、10或12所示的多肽。

5.如权利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体，或含有权利要求3-4中任一项所述的多核苷酸。

8.一种筛选脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括以甘油三酯作为待筛选脂肪酶的底物进行酶解并根据pH指示剂产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提供待筛选的脂肪酶；

(2)提供含有pH指示剂和低级烷基羧酸盐的溶液；

(3)将甘油三酯加到步骤(2)的溶液中，得到混合液；

(4)将脂肪酶加到步骤(3)所得的混合液中；和

(5)观察混合液颜色的变化，根据pH指示剂所产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶。

10.如权利要求8-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯。

11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐。

12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。

13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用野生型脂肪酶作为对照，通过对比待筛选脂肪酶产生的颜色与对照产生的颜色筛选出比活力提高的脂肪酶。

14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是使用多孔板进行筛选。

15.如权利要求8-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

建立脂肪酶突变文库；

表达突变脂肪酶。

16.如权利要求8-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：采用碱滴定法对所筛选得到的脂肪酶进行复筛，筛选出比活力提高的脂肪酶。

17.一种用于筛选脂肪酶的反应体系，其特征在于，所述反应体系含有：

(1)甘油三酯；和

(2)pH指示剂。

18.如权利要求17所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还含有低级烷基羧酸盐。

19.如权利要求17-18中任一项所述的反应体系，其特征在于，每200μl所述反应体系计，所述反应体系含有15～25μl的pH指示剂溶液、50～70μl的0.1～0.3M低级烷基羧酸盐的Tris缓冲溶液、和80～120μl甘油三酯溶液，其中，所述pH指示剂溶液为pH指示剂以0.3～1.5mg/L的浓度溶解于Tris缓冲液，所述甘油三酯溶液为甘油三酯以1：4～6的体积比溶于有机溶剂而获得的溶液。