[发明专利]脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。具体而言，本发明涉及一种脂肪酶基因突变库高通量筛选方法及由此筛选得到的新的脂肪酶突变基因。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、还可以用于催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。脂肪酶在粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。在油脂生产和油脂化工方面，脂肪酶具有巨大应用潜力。利用其专一性催化性能，改变脂肪酸链在甘油酯中的位置或替换上1个或多个新的脂肪酸来修饰酯，将廉价的油脂原料加工成昂贵的结构脂，如可可脂、OPO，单苷脂和苷二脂等。

提高脂肪酶的催化比活力，是降低脂肪酶生产成本的有效的途径之一。本发明以具有1，3专一性的米黑根毛霉脂肪酶为研究对象，首先采用易错PCR方法(ep-PCR)，在大肠杆菌中建立脂肪酶突变库，通过新的高通量筛选方法，对突变库进行筛选，获得了比活力提高的RML突变脂肪酶和相应的突变基因。

发明内容

本发明提供一种分离的多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示氨基酸序列；和

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计第57位氨基酸残基为Val，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。

在一具体实施例中，以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计，上述(2)所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。

本发明提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码本发明所述多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一具体实施例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示的多肽。

在一具体实施例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示。

本发明提供一种载体，它含有本发明所述的多核苷酸。

本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明所述的载体或多核苷酸。

本发明提供一种筛选脂肪酶的方法，所述方法包括以甘油三酯作为待筛选脂肪酶的底物进行酶解并根据pH指示剂产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶的步骤。

在一具体实施例中，所述方法包括以下步骤：

(1)提供待筛选的脂肪酶；

(2)提供含有pH指示剂和低级烷基羧酸盐的溶液；

(3)将甘油三酯加到步骤(2)的溶液中，得到混合液；

(4)将脂肪酶加到步骤(3)所得的混合液中；和

(5)观察混合液颜色的变化，根据pH指示剂所产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶。

在一具体实施例中，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯。

在一具体实施例中，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐。

在一具体实施例中，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。

在一具体实施例中，所述方法还包括使用野生型脂肪酶作为对照，通过对比待筛选脂肪酶产生的颜色与对照产生的颜色筛选出比活力提高的脂肪酶。

在一具体实施例中，所述方法是使用多孔板进行筛选。

在一具体实施例中，所述方法还包括：

建立脂肪酶突变文库；

表达突变脂肪酶。

在一具体实施例中，所述方法还包括：采用碱滴定法对所筛选得到的脂肪酶进行复筛，筛选出比活力提高的脂肪酶。

本发明提供一种用于筛选脂肪酶的反应体系，所述反应体系含有：

(1)甘油三酯；和

(2)pH指示剂。

在一具体实施例中，所述反应体系还含有低级烷基羧酸盐。