[发明专利]诱导性多能干细胞的制备方法和用于制备诱导性多能干细胞的培养基

权利要求书

1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

步骤2，使用干细胞培养基对步骤1中制备的导入了干细胞多能性因子的体细胞进行培养，其中，在该过程中，进一步包括使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养；和

步骤3，鉴定诱导性多能干细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括将报告基因导入体细胞，以此报告基因来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生效率。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP，优选为Oct4-GFP。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1中，将所述干细胞多能性因子的cDNA以病毒感染方式导入小鼠胚胎成纤维细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子选自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤1中，所述干细胞多能性因子为包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的四因子，或者为包括Oct4、Sox2和Klf4的三因子，或者为包括Oct4和Sox2的二因子。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，从导入所述因子后第3至6天开始使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养1至9天。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，在导入所述因子后第3至第6天，或者在导入所述因子后第3至第8天，或者在导入所述因子后第3至第10天，或者在导入所述因子后第3至第12天，或者在导入所述因子后第6至第9天，使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述高渗透压培养基是通过在普通等渗培养基中外加离子型或非离子型渗透压调节物质(优选为NaCl、蔗糖、甘露醇、Na₂SO₄和葡甲胺)而制备的培养基，更优选地，所述渗透压调节物质包括NaCl和蔗糖，最优选地，所述渗透压调节物质为NaCl。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述高渗透压培养基的渗透压为380～480mOSM/kg。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤2中，所述高渗透压培养基为提高渗透压的mES培养基和/或提高渗透压的KSR培养基，优选地，所述高渗透压培养基进一步包含选自VPA、LiCl、CHIR99021、Repsox和Parnate中的小分子化合物，其中，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM；以及所述KSR培养基为添加有15％替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的Knockout DMEM。

12.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述使用高渗透压培养基对所述细胞进行培养为先使用提高渗透压的mES培养基对所述细胞进行培养0至3天，再使用提高渗透压的KSR培养基对所述细胞进行培养0至6天。