[发明专利]诱导性多能干细胞的制备方法和用于制备诱导性多能干细胞的培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及诱导性多能干细胞的制备方法和用于制备诱导性多能干细胞的培养基。

背景技术

胚胎干细胞被誉为″万能细胞″，从理论上讲，可分化为人体220种细胞中的任何一种，从而构成机体各种复杂的组织器官，随着1981年小鼠胚胎干细胞和1998年人的胚胎干细胞的建系成功[1-2]，再生医学的研究真正开始。胚胎干细胞的应用前景主要是用于移植治疗，以胚胎干细胞作为起始细胞，通过体外培养及定向分化，可以为临床治疗中提供大量的组织和器官的移植材料。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如神经细胞、心肌细胞等)已经具备了成熟的分化方法和相应的检测标准。它可以用于治疗帕金森氏症、脊髓损伤和糖尿病等组织器官缺损或功能障碍等多种疾病。但一直以来，为了获取人体ES细胞，必须摧毁胚胎，这一点使胚胎干细胞治疗研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍。于是科学家们开始寻求不通过胚胎而将分化细胞重编程直接逆转为干细胞的新方法。

2006年8月，Yamanaka小组将24种转录因子排列组合导入小鼠成纤维细胞，最终确定最少有4种转录因子组合-Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将小鼠成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent StemCells，iPS Cells)[3]。2007年底，Yamanaka小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞[4-5]。2009年，研究人员首次利用iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，证明了iPS细胞具有真正的全能性[6]。iPS作为诱导产生多能性干细胞的一种技术，在临床疾病治疗方面的应用价值是巨大的，因为它不像传统的核移植或者细胞融合等获取干细胞的方式那样需要人的卵子或人的胚胎干细胞，从而绕开了伦理和法律等诸多障碍，并且它利用由成体细胞重编程为干细胞的特性避免了免疫排斥使得自体移植变得更加可行；另一方面，iPS对于干细胞自我更新机制的研究、干细胞信号调控的研究以及探索很多疾病的发病机制并寻找治疗方法都有很大意义。

但是，iPS细胞的应用仍然有两大难题亟待解决：生物安全问题和诱导效率问题。在生物安全问题方面，最初实验体系中过表达的外源基因中含有两个原癌基因(c-Myc，Klf-4)，并且外源基因的导入方式是通过逆转录病毒，病毒在基因组中有多个拷贝的插入也会导致基因突变及癌变。因此，大家致力于优化iPS技术以提高其应用的安全性，例如，借助转座子介导的转基因方法高效制备了无病毒(virus-free)iPS细胞[7-8]；成功地从所获得的iPS细胞中移除先前导入的转录因子基因[9]；iPS的诱导过程中使用特定小分子化合物，在更少的外源基因导入的情况下即可高效率获得iPS细胞[10-17]；以及直接通过添加透膜的转录因子蛋白的形式进行重编程[18]。这些发现使人们向制备无遗传修饰的iPS细胞迈出了一大步。另外诱导效率也是制约iPS细胞技术发展和应用的一个限速步骤，最初iPS的诱导效率一般都低于1％，而选用小分子化合物可大幅度提高重编程效率并且减少转录因子使用个数。同时，小分子资源丰富而且组合应用灵活多样，通过加入小分子改变细胞培养环境，从而激活细胞重编程相关信号通路，提高体细胞重编程效率，这一技术领域正逐步为各国科学家所重视。细胞的培养环境对干细胞自我更新和分化尤为重要，通过添加利于干细胞生长的生长因子可以抑制干细胞分化，促进自我更新(例如在培养基中加入LIF(适合鼠干细胞)，加入bFGF(适合人干细胞)等等[19-20])；同样在体细胞重编程过程中微环境的优化也可以显著提高iPS细胞诱导效率。除了添加相应生长因子及小分子化合物改变细胞生长微环境之外，低氧这一物理环境的改变也可以提高人和小鼠体细胞重编程效率或者促进ES细胞自我更新等等[21-23]，因此，物理环境的改变也是提高诱导重编程效率的一个值得探索的方向，对理解重编程机制也有着十分重要的作用。