[发明专利]可回复性永生化大鼠骨髓间充质干细胞及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种可回复性永生化细胞，还涉及该可回复性永生化细胞的制备方法和应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是存在于骨髓、外周血和脐血等组织中的一类具有自我更新及跨胚层分化潜能的干细胞，具有易于体外分离、培养和扩增，容易导入外源基因，能在特定组织定居或归巢、低免疫原性和多向分化潜能等特点。在特定的体外诱导环境下MSCs可分化为神经样细胞，动物实验也显示MSCs移植可在中枢神经系统内存活并能分化为有功能的神经样细胞，为神经系统疾病的治疗带来了新的希望。

虽然MSCs在体内有着强大的增殖潜能，能多次分裂增殖，但在体外分离培养过程中，由于失去了神经体液的调节和细胞间的相互作用，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，细胞生存时间短，增殖能力有限且易发生变性。因此，获得体外增殖良好并具有正常性状的MSCs是MSCs体内外研究及临床应用的重要保障。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可回复性永生化大鼠MSCs，能在体外长期传代培养，增殖能力强且性状不发生改变，还可以容易地回复到永生化前的状态，生物安全性好，可以克服原代大鼠MSCs体外生存时间短、增殖能力有限且易发生变性的缺点。

为达到上述目的，本发明提供的可回复性永生化大鼠MSCs，携带有SV40T(即猿病毒40大T抗原)基因及潮霉素抗性基因，所述SV40T基因的两端还有同向的Loxp位点。

将SV40T基因导入大鼠MSCs，可调节细胞周期中的重要调控点，使细胞进入永生化的增殖状态，成为能在体外长期传代培养的永生化细胞系。在SV40T基因的两端各加上1个Loxp位点并使2个Loxp位点的方向相同，利用Cre-LoxP重组酶系统的特性(如果2个LoxP位点位于1条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效切除2个LoxP位点间的序列)，则SV40T基因能被Cre重组酶定向敲除，从而可使永生化的细胞回复到永生化前的状态。

本发明的目的之二在于提供所述可回复性永生化大鼠MSCs的制备方法，操作简便、快速。

为达到上述目的，本发明提供的可回复性永生化大鼠MSCs的制备方法，包括以下步骤：

a． 将逆转录病毒表达质粒SSR69与包装质粒pAmhpo共转染HEK293细胞，获得重组逆转录病毒；

b．将步骤a所得重组逆转录病毒感染大鼠MSCs，用潮霉素进行筛选，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。

逆转录病毒表达质粒SSR69中含有SV40T基因及潮霉素抗性基因，所述SV40T基因的两端有同向的Loxp位点。将步骤a所得重组逆转录病毒感染大鼠MSCs，用潮霉素筛选阳性克隆，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。优选的，所述步骤b是将步骤a所得重组逆转录病毒感染第3代大鼠MSCs，感染后第3天用浓度为4μg/ml的潮霉素筛选2周，即得具有潮霉素抗性的可回复性永生化大鼠MSCs。

本发明的目的之三在于提供所述可回复性永生化大鼠MSCs的应用。

体内外实验结果显示，本发明的可回复性永生化大鼠MSCs在体外能向神经元样细胞分化，移植入体内能改善新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)，因此，本发明的可回复性永生化大鼠MSCs可作为成神经诱导分化的种子细胞以及治疗新生大鼠HIBD的种子细胞应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过将LoxP位点特异修饰的SV40T基因导入大鼠MSCs，构建了可回复性永生化细胞株，该细胞株具有与原代大鼠MSCs同样的生物学特性，还具有体外增殖能力强，生物学性状稳定，可回复到原有状态，生物安全性好等特点，能代替原代大鼠MSCs进行体外神经分化及体内移植治疗神经系统疾病的实验研究，因此，本发明为上述研究提供了重要的细胞工具。

附图说明

图1是第3代大鼠MSCs光镜图(A, 100×)和H.E染色图(B, 100×)。

图2是第3代大鼠MSCs表面标志CD34、CD45、CD90及CD106的流式细胞检测图。

图3是可回复性永生化大鼠MSCs 潮霉素筛选图。

图4是第10代可回复性永生化大鼠MSCs光镜图(A, 100×)和H.E染色图(B, 100×)。

图5是第10代可回复性永生化大鼠MSCs表面标志CD34、CD45、CD90及CD106的流式细胞检测图。