[发明专利]从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法

权利要求书

1.一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)植物源材料的处理

将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10～15天，得到富集液；

(2)乳酸菌的分离与纯化

A、在无菌条件下，吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的梯度稀释液；

B、取上述不同梯度的稀释液各0.05～0.2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面；

C、在25℃～35℃的无氧条件下，将上述平板静置培养1～5天；

D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25℃～35℃的无氧条件中培养1～5天；

E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；

(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选

A、将步骤(2)得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25℃～35℃无氧条件下静置培养24～48h，得到菌株的发酵液；

B、在4℃条件下，分别将上述发酵液经7000～10000r/min离心10～25min，保留上清液；

C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；

(4)产细菌素乳酸菌的筛选

将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；

(5)产细菌素乳酸菌的验证

将(4)中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。

2.根据权利要求1所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的植物源材料为植物的根、茎、叶、果实、种子。

3.根据权利要求2所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。

4.根据权利要求1～3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选，C步骤通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株的具体操作方法如下：将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃培养5～10h，OD₆₀₀为0.2～0.4；取指示菌菌液0.1～0.3mL，与5～8mL经融化后保持在45℃左右的LB半固体培养基混匀，立即倒在素琼脂平板上；待所述混匀物凝固，放上牛沣杯，每个平板放置1～6个，并分别向牛沣杯中加入B步骤制备好的上清液0.1～0.2mL；将平板放于4℃冰箱中静置4～10h，然后在28～37℃培养6～12h，观察牛沣杯周围是否有抑菌圈形成，以得到产抑菌物质的菌株。

5.根据权利要求1～3任一项所述的从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于：所述(4)产细菌素乳酸菌的验证，硫酸铵沉淀法具体操作如下：将(3)A步骤得到的产抑菌物质菌株的发酵上清液，以饱和度为80～100％硫酸铵沉淀，在4℃冰箱中静置过夜，在4℃下，7000～10000r/min离心40min得到沉淀；将所得沉淀溶解在二级水中，用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将所得冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯双层平板扩散法检测是否有抑菌圈形成，以进一步通过酶解实验验证得到的抑菌物质为细菌素。