[发明专利]从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从植物源材料中筛选获得产细菌素乳酸菌菌株的方法。

背景技术

细菌素是细菌通过核糖体合成的一类蛋白或多肽类物质，因其具有抑菌活性而受到广泛的关注。与化学类防腐剂和抗生素相比，细菌素作为一种蛋白类物质，抑菌活性强，稳定性好，可被酶解而不会残留于人体内，不易引起抗药性，具有较高的安全性，可广泛应用于食品天然防腐剂及医药领域。很多乳酸菌是细菌素的产生菌，其中由乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin，已被FAO批准用于食品生物保鲜中，但由于Nisin仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，抑菌谱较窄，并且在中性条件下溶解性差，稳定性较低，因而极大地限制了Nisin在食品防腐保鲜中的应用。因此，为开发新的具有优良性能的细菌素，筛选出产细菌素的乳酸菌是应用研究的第一环节。

目前，筛选产细菌素乳酸菌的方法主要包括以下几步：先筛选出产酸菌株，再通过将发酵上清液的pH调至5.5～6.0做抑菌实验以排除发酵液中酸对指示菌的抑制作用，再通过过氧化氢酶处理的上清液做抑菌实验来排除过氧化氢对指示菌的抑制作用。进一步通过酶解实验，确认筛选出的菌株可以产生蛋白质性质的抑菌物质-细菌素。但由于乳酸菌在发酵过程中除了可以产生各种有机酸和过氧化氢等抑菌物质外，还会产生如双乙酰等小分子抑菌物质，因此传统的常规方法不能够完全排除小分子的影响，而且实验结果的准确度不高，往往有一些假阳性的结果。此外，相当一部分细菌素属于酸依赖型细菌素，若将发酵上清液的pH调至5.5～6.0，这些酸依赖型的细菌素就会失去活性，从而无法筛选出这些产细菌素的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种从植物源材料中筛选产细菌素乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)植物源材料的处理

将植物源材料剪成小块后装入试管，或将植物源材料直接加入试管，向试管中加入适量无菌水，压实后密封，室温下富集10～15天，得到富集液；

(2)乳酸菌的分离与纯化

A、在无菌条件下，吸取0.1mL富集液，进行梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的梯度稀释液；

B、取上述不同梯度的稀释液各0.05～0.2mL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面；

C、在25℃～35℃的无氧条件下，将上述平板静置培养1～5天；

D、根据菌落形态的差异，用接种环挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行四区划线，置于25℃～35℃的无氧条件中培养1～5天；

E、持续D步骤的操作至少2次，直至菌落完全纯化；

(3)产抑菌物质的乳酸菌的筛选

A、将步骤(2)得到的完全纯化的菌株分别接入MRS液体培养基中，在25℃～35℃无氧条件下静置培养24～48h，得到菌株的发酵液；

B、在4℃条件下，分别将上述发酵液经7000～10000r/min离心10～25min，保留上清液；

C、通过牛沣杯双层平板扩散法筛选出产抑菌物质的菌株；

(4)产细菌素乳酸菌的筛选

将上述产抑菌物质的菌株的上清液用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析6～12h，将透析液冷冻干燥制成冻干粉；将冻干粉溶解在二级水中，浓度为20～200mg/mL，通过牛沣杯扩散法检测冻干粉制备的样品是否产生抑菌圈，并保存产细菌素的菌株；

(5)产细菌素乳酸菌的验证

将(4)中得到的产细菌素菌株的发酵上清液通过硫酸铵沉淀法进一步验证抑菌物质为细菌素。

本发明中，所述的植物源材料为植物的茎、叶、根、果实或种子。

进一步的，所述的植物源材料为新鲜的马齿苋、蓬蓬菜、花椰菜、西红柿、大白菜或小米。

本发明还可以通过以下技术措施得以进一步实现：