[发明专利]聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物的方法，具体涉及聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF或PEG-G-CSF)的纯化方法，属于医药技术领域。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一，由175个氨基酸组成，是一种水溶性的蛋白，具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能，在预防和治疗多因素引起的中性粒细胞减少症及其并发症(如发热、感染等)方面疗效显著。1991年，Amgen(安姆根)公司的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)被FDA批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治疗。但作为一种生物大分子药物，rhG-CSF像大多数生物制品一样，在临床应用中存在体内半衰期短，易被酶水解和肾脏清除等问题。在化疗过程中，需要长达两周的持续每日静脉或皮下注射，造成病人依从性较差。

聚乙二醇(PEG)修饰是实现蛋白质药物长效的一种应用较为广泛的方法，PEG修饰的蛋白质和多肽类药物半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，毒副作用减少。PEG修饰的rhG-CSF实现了长效增加外周血中性粒细胞数的目的，2002年，FDA又批准了Amgen公司的聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)上市，商品名Neulasta。PEG-G-CSF是由单甲氧基聚乙二醇丁醛与大肠杆菌表达纯化的蛋氨酰化的粒细胞集落刺激因子N-末端赖氨酸氨基共价连接而成，与G-CSF相比其在体内的半衰期明显延长，因而可以减少治疗时的注射次数，减少病人的痛苦。

在PEG-G-CSF的纯化过程中，需要去除PEG与G-CSF交联反应液中的交联剂、二交联的G-CSF及未交联的G-CSF等。由于交联产生的多种不同交联蛋白异构体，除了分子量有所区别外，其他性质如表面电荷、疏水性等差别较小，因此，分离纯化交联蛋白产物，成为聚乙二醇化技术的难点之一。安姆根公司在专利CN1071760C中公开了N-末端PEG化rh-G-CSF的纯化方法，将交联反应混合物上样于阳离子交换层析柱Sepharose FF柱，以醋酸钠缓冲液平衡后进行线性洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再进行分子筛层析的方法来纯化。虽然，分子筛层析能够去除分离各种交联异构体，但是由于分子筛很难在工业中实现放大，因此国内大多数的纯化方法是根据表面电荷的差异，采用离子交换层析进行分离纯化，例如CN1663962A公开了PEG-G-CSF的一步纯化方法，采用阳离子交换层析柱SP Sepharose F.F.装柱后用乙酸-乙酸钠缓冲液平衡，再用不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲液洗脱。此纯化工艺虽然可以实现工业上的放大，但由于采用的是作用比较单一的阳离子交换介质进行吸附-解析来进行分离，其内毒素很难控制，导致终产品中内毒素含量不容易控制，影响了产品的质量。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，本发明的发明人对各种层析方法进行了大量的研究，发现利用脱盐层析、离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化，能够获得高纯度的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子。本发明纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过一个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，增加了工艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为一个步骤。本工艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，节省了生产时间，提高了生产效率，十分适合大规模工业化放大生产。

实施本发明的前期步骤为现有技术：可以采用CN1071760C中公开的方法来获得聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液，将该交联液作为后续处理的对象。

该方法主要步骤在于：将经过脱盐后的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，利用内毒素与阴离子交换层析柱的高度吸附作用达到去除内毒素的目的；

之后采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；

更进一步的，本发明的具体处理步骤如下：

(1)聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液经过葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)脱盐，得脱盐液；

(2)脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上，至上样完毕；