[发明专利]一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的重组人apoE拟肽（EpK），其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的一种重组人apoE拟肽（EpK）的制备方法，其步骤是：

（1）重组载体的构建及EpK肽的表达：

利用人apoE的结构功能域，设计了一种含人apoE的一段N端LDLR结合区和一段C端脂质结合区的衍生肽，此肽包含N端的一个半胱氨酸，通过六个赖氨酸残基连接apoE的 LDLR结合区及脂质结合区；

所述的人apoE的N端 LDLR结合区为第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂质结合区为第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段；

首先利用BLAST软件设计寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应合成编码EpK 的DNA序列，编码EpK 的DNA序列如下：

5’TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAAGCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCTGCAAGCGGAG 3’

DNA序列亚克隆插入到pTWIN1载体中与N端内含肽融合；

重组质粒转化至大肠杆菌BL21pLysS感受态细胞，利用LB培养平板筛选，证实EpK于BL21pLysS细菌中高效表达，然后于37℃液体LB培养基培养细菌直到OD₆₀₀达到0.8～1.0，加入IPTG至终浓度0.5 mM，再于25℃诱导蛋白表达8～10小时；

（2）EpK肽的纯化：

离心收集诱导表达的细菌沉淀，用buffer B1重悬并超声裂解，然后进行两步纯化：首先，细胞提取物上样到装有Chitin beads的层析柱，用buffer B1洗去未结合的蛋白质，加入buffer B2于室温下平衡过夜，使Chitin beads上的intein tag剪切，再用足量的buffer B2洗脱目的多肽；第二步，洗脱出的多肽用10 mM磷酸盐结合缓冲液（PBS）按1∶10比例稀释，并上样至肝素亲和柱中，然后用15倍柱床体积的PBS，洗去微量的未结合的intein tag、chitin结合区蛋白以及其他的杂质蛋白，目的多肽EpK最后通过增高NaCl的浓度而洗脱，收集含500～600 mM NaCl的梯度洗脱液，并在10 mM NH₄HCO₃进行透析，最后冻干保存EpK粉末；

（3）纯化后EpK肽的鉴定：

EpK的最终产率是1L LB培养菌获得5～10 mg，经15%还原型SDS-PAGE证实两步纯化后为一条蛋白带，提示为高纯的多肽，质谱证实了其正确的分子量、纯度和部分二聚体的形成。

3.权利要求1所述一种重组apoE拟肽在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致心脑血管疾病药物中的用途。

4.权利要求1所述的一种重组apoE拟肽在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致冠心病药物中的应用。

5.权利要求1所述的一种重组apoE拟肽在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致心肌梗塞疾病药物中的应用。

6.权利要求1所述的一种重组apoE拟肽在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致中风疾病药物中的应用。