[发明专利]胸腺肽α1的固相合成工艺

权利要求书

1.一种胸腺肽α1的固相合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成；

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备；

(4)用裂解剂制备胸腺肽α1粗肽；

(5)胸腺肽α1粗肽的纯化。

2.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中载体采用的为与氨基酸结合副反应少的CTC树脂。

3.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：步骤(2)中氨基酸激活试剂采用的是缩合效率更高的HATU和消旋化影响极低的NMM。

4.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：步骤(3)乙酸酐和吡啶的摩尔用量均为树脂取代摩尔数的20倍。

5.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：步骤(4)的裂解剂是：三氟乙酸/二巯基乙醇/水，按照90∶5∶5的体积配制而成，在-10℃预冷12小时，裂解切肽时将裂解液倒入预冷的乙醚中在室温下反应2.5-3小时，沉降粗肽时乙醚体积用量是裂解试剂的10倍，沉降完成后用离心的方法对粗肽进行洗涤浓缩。

6.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：步骤(5)中纯化方法采用的是两次纯化用不同的反相C18填料。

7.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：

(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备：Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂加入至反应器中，加入DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，除去液体，然后向反应器中加入哌啶/DMF溶液进行反应，反应完毕抽去液体，用DMF洗涤，再加入哌啶/DMF溶液，搅拌反应后抽除，用DMF洗涤，洗去脱下的Fmoc保护基，

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成：取Fmoc-Glu(OtBu)-OH，HATU，溶于DMF中，加入冷却的NMM，激活后加入到反应器中反应，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入DMF洗涤。按照胸腺肽α1氨基酸序列，重复以上的操作步骤，将其余26个氨基酸依次偶联到树脂上，然后用哌啶/DMF脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂，

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备：AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC，乙酸酐，吡啶，DMF混合均匀后加入至反应器中反应，抽滤除去溶液；依次加入DMF洗涤，DCM洗涤，MeOH洗涤，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂，

(4)裂解制备粗肽：裂解液，胸腺肽α1肽树脂冰浴下混合反应；然后过滤除去树脂，滤液加入到冰乙醚中沉降，分离制得胸腺肽α1粗肽，

(5)胸腺肽α1粗肽的纯化：以TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18，采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90％，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90％纯化液，合并所有含量在90％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，以磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18采用梯度洗脱，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5％，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5％纯化液，合并所有含量在98.5％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，进行下一步脱盐纯化，以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；色谱系统采用反相C18填料柱，取第二次纯化得到的目的肽，采用梯度洗脱，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液用微孔滤膜精密过滤，冻干。

8.根据权利要求1的固相合成方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：

(1)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成

称取替代度为0.60mmol/g的Fmoc-Asn(Trt)-CTC树脂66.7g(40mmol)，加入至反应器中，加入500ml DMF，打开氮气自下而上柔和冲混液体和树脂，搅拌溶胀30分钟后停止，抽滤除去液体，然后向反应器中加入20％的哌啶/DMF溶液(脱帽液)500ml，在氮气保护下搅拌反应5分钟，抽去液体，用500ml DMF洗涤2次，再加入500ml脱帽液，搅拌反应10分钟后抽除，用500ml DMF洗涤8次，洗去脱下的Fmoc保护基，

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的制备：

称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 68g，HATU 60.8g，溶于500ml DMF中，冰浴下加入冷却的NMM 26.5ml，激活10分钟后加入到反应器中，在15℃～25℃下反应2.5-3小时，以茚三酮显色法检测为准，然后抽滤除去反应液，加入400ml DMF洗涤3次。遵循多肽固相合成方法的一般规律，重复以上的操作步骤，按照胸腺肽α1氨基酸序列，依次把其余的26个氨基酸偶联至CTC树脂上，直至最后Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联完毕。然后用脱帽液脱去Fmoc保护，得到AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂，

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备

配制乙酰化溶液：乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMF1000ml，混合均匀后加入至含有AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的反应器中，在氮气保护下反应24小时，然后抽滤除去乙酰化溶液，依次加入1000ml DMF洗涤6次，1500ml DCM洗涤3次，1000ml MeOH洗涤3次，每次洗涤5分钟，转出树脂，减压干燥，得到胸腺肽α1肽树脂242.2g，

(4)树脂肽裂解制备粗肽

配制三氟乙酸/二巯基乙醇/水＝90∶5∶5(v/v)裂解液2400ml，在-10℃下预冻12h，将242.2g肽树脂于圆底烧瓶中，冰浴下冷却，加入已经预冻好的裂解液2400ml，加入完成后撤除冰浴，室温下搅拌反应2.5小时，然后过滤除去树脂，滤液加入到10倍体积冰乙醚中，沉降5小时，4000转/分钟离心洗涤8次，转出沉淀，减压干燥，制得胸腺肽α1粗肽73.5g，

(5)胸腺肽α1粗肽的溶解

将73.5g粗肽研磨至粉末状，然后加入735ml纯水搅拌20分钟，滴加氨水将溶液pH值调至6.5-7.0之间，用纯水定容至4L，然后用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用1.0％TFA水溶液调pH值至2.0-2.5之间，再用0.45μm微孔滤膜过滤，

(6)胸腺肽α1粗肽的纯化

一次纯化

以0.1％TFA溶液为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5％的乙腈，平衡15分钟，进样，采用梯度洗脱：0～2min，5％～5％；2～42min，17％～23％；42～48min，50％～50％，出峰时间在37min左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶收集液纯度大于90％，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于90％纯化液，合并所有含量在90％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，准备二次纯化，

二次纯化

以0.2％磷酸溶液(用氨水调pH至6.5)为流动相A，乙腈为流动相B；制备液相色谱系统采用5μm的反相C18(41.4×250mm)填料，紫外检测器设定220nm，调流速60ml/min，以5％的乙腈，平衡15分钟，取第一次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱：0～2min，5％～5％；2～32min，9％～15％；32～40min，40％～40％，出峰时间在25min左右，分别收集峰前、峰顶、峰后三段，峰顶纯度大于98.5％，峰前及峰后的收集液浓缩至适量后，采用同样的方法纯化收集得纯度大于98.5％纯化液，合并所有含量在98.5％以上的收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈，

脱盐

以注射用水为流动相A，乙腈为流动相B；准备制备液相色谱系统，采用10μm的反相C18(41.4×250mm)填料柱，紫外检测器设定220nm，调流速40ml/min，先以80％的乙腈，平衡10分钟，然后以2％的乙腈，平衡15分钟，取第二次纯化得到的目的肽收集液，进样，采用梯度洗脱：0～15min，5％～5％；15～65min，5％～40％，主峰出现时开始收集至无峰出现时结束，合并收集液，旋转浓缩除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α1精制液660ml，

冻干

取脱盐后的的胸腺肽α1精制液，用0.22μm微孔滤膜精密过滤，分装不锈钢盘冻干，制得胸腺肽α1纯品25.3g。