[发明专利]胸腺肽α1的固相合成工艺

说明书

技术领域

本发明涉及多肽的合成和纯化方法，尤其涉及胸腺肽α1的固相合成工艺。

背景技术

1977年，被称为“胸腺之父”的Allen Goldstein博士从胸腺肽第5组分中提取出其中最具免疫活性的成分：胸腺肽α1。胸腺肽α1是一种生物反应调节剂(BRM)，由28个氨基酸残基构成，氨基酸序列如下：

N-乙酰化-L-丝氨酰-L-天冬氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-缬氨酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰-L-丝氨酰-L-丝氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-苏氨酰-L-苏氨酰-L-赖氨酰-L-天冬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-赖氨酰-L-赖氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-L-天冬酰胺。

N末端被乙酰化，分子量为3108。主要存在于胸腺中，在脾、肺、肾、脑等其他组织中也有低水平存在。胸腺肽α1是一种免疫调节因子，在T淋巴细胞成熟和免疫功能方面有很大的作用，这些作用包括：诱导分化的特异标志；促进干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)及其受体表达；增强细胞在外源因子刺激时的生长；启动T淋巴细胞的成熟、刺激分泌干扰素及各种淋巴介素，以及增强自然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性；促使骨髓产生的干细胞成长为能够特异识别抗原的功能T细胞，增加各种淋巴因子如α、β干扰素的分泌，从而有增强细胞免疫功能的作用。作为天然胸腺激肽的主要组分α1大致含量在整个胸腺肽组成中约占1％左右。胸腺肽α1与胸腺肽各单一组分间，或与胸腺肽整体比较，生物活性均为最高，其活性相当于胸腺肽的2000倍，相当于胸腺五肽的10到1000倍。

胸腺肽α1最早由意大利塞生公司(Sciclone)在1997年开发上市，药品名“日达仙”(Zadaxin)。作为一种细胞免疫剂增强剂，胸腺肽α1受到医学界越来越多的重视。它对慢性乙型肝炎、重型病毒性肝炎、肿瘤、流行性乙型脑炎等疾病的治疗效果明显，副作用少，具有较高的临床研究价值和应用前景。在临床上主要用于：①治疗慢性乙型肝炎；②在肿瘤治疗中的应用；③治疗重症肝炎；④治疗流行性乙型脑炎；⑤治疗外科感染性疾病。

目前胸腺肽α1的合成与制备的方法主要有两种，基因工程方法和化学固相合成方法。专利CN02125267.X公布了一种利用生物工程技术将胸腺肽基因进行重组，在宿主细胞中表达重组基因获得胸腺肽融合体，再利用化学技术将融合体裂解和修饰的到胸腺肽α1的方法。专利CN200410077749.2采用的方法是将胸腺肽α1定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1，该质粒可以表达出硫氧还蛋白-胸腺肽α1融合蛋白，再经过一系列后处理和纯化可以得到胸腺肽α1。基因工程方法的缺点是表达量比较低，而且所需费用较高，很难实现产业化。《化学工业与工程》2001年18卷第6期《胸腺素α1的Fmoc固相合成法》描述了一种以王树脂为载体，用对称酸酐法和DCC-HOBt缩合法合成胸腺肽α1的方法。《化工学报》2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》描述了一种以王树脂为载体，以DIC-HOBt为氨基酸激活试剂合成胸腺肽α1的方法。《南京工业大学学报》2004年第26卷第2期《固相合成胸腺素α1》中的合成方法也是采用王树脂为起始原料，但氨基酸激活试剂采用的是TBTU-HOBt。这几种化学固相合成方法采用的都是先进的Fmoc方法，并且均以王树脂为载体。不足之处是王树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH的结合比较困难，还存在切割的时候linker被切除连接在肽链上的副反应，会对收率有一定的影响。而且其方法中的氨基酸缩合剂TBTU-HOBt，DCC-HOBt，DIC-HOBt相对而言缩合效率不是很高，对于胸腺肽α1这种比较长的肽，空间结构影响较大，会对收率造成影响，导致成本升高，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是对现有的固相合成技术进行优化，解决胸腺肽α1合成工艺中存在的一些问题，提供一种收率更高、成本更低、有利于实现产业化的胸腺肽α1的固相合成工艺以及一种胸腺肽α1粗肽的纯化方法。

本发明提供一种胸腺肽α1的固相合成方法，该方法包括下列步骤：

(1)NH₂-Asn(Trt)-CTC树脂的制备；

(2)AA^(1-27)-Asn(Trt)²⁸-CTC树脂的合成；

(3)Ac-AA^(1-27)-Asn²⁸(Trt)-CTC树脂的制备；