[发明专利]自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基

权利要求书

1.体外培养人NK细胞的成套培养基，由培养基1、培养基2和培养基3组成；所述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素15、人白细胞介素18、植物血凝素、抗人T细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培养基；

所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述抗人T细胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；

所述培养基3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2相同。

2.根据权利要求1所述的成套培养基，其特征在于：所述培养基1、培养基2和培养基3中，所述人白细胞介素2的终浓度均为500U/ml，所述人白细胞介素12的终浓度均为10ng/ml，所述人白细胞介素15的终浓度均为20ng/ml，所述人白细胞介素18的终浓度均为10ng/ml；

所述培养基1和培养基2中，所述离体的人血浆终浓度均为5％(体积百分比)；

所述培养基1中，所述植物血凝素(PHA)的终浓度为2μg/ml、抗人T细胞CD3单克隆抗体(OKT3)的终浓度为100ng/ml；

所述培养基3中，所述离体的人AB血清的终浓度为5％(体积百分比)。

3.体外培养人NK细胞的产品，由权利要求1或2所述的体外培养人NK细胞的成套培养基和饲养细胞组成，所述成套培养基和所述饲养细胞均独立包装；所述饲养细胞为将离体的人PBMC细胞经射线辐照后得到的细胞；所述饲养细胞和所述成套培养基中的所述离体的人血浆均来自同一个体。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述饲养细胞为将离体的人PBMC细胞经30Gyγ射线辐照后得到的细胞。

5.根据权利要求3或4所述的产品，其特征在于：所述γ射线辐照中的辐照速率为200cGy/min。

6.权利要求1或2所述的成套培养基的制备方法，包括如下步骤：分别制备所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3，再将所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3分别进行独立包装，得到所述成套培养基。

7.权利要求3-5中任一所述产品的制备方法，包括如下步骤：将按照权利要求6所述的方法制备得到的成套培养基和权利要求3-5中任一所述的饲养细胞分别独立包装，得到所述体外培养人NK细胞的产品。

8.利用权利要求3至5中任一所述的产品体外培养人NK细胞的方法，包括以下步骤：1)将离体的人NK细胞作为种子加入所述培养基1中并添加所述饲养细胞培养3-4天后，将经所述培养基1培养的人NK细胞转入所述培养基2中并添加所述饲养细胞培养至第14天，第15天开始将经所述培养基2培养的人NK细胞转入所述培养基3中并添加所述饲养细胞进行培养，直至第21天得到扩增后的人NK细胞；上述培养时间均以接入所述培养基1的时刻为0时刻；

所述离体的人NK细胞、所述饲养细胞和所述离体的人血浆来自于同一个体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述饲养细胞和所述离体的人NK细胞按照10∶1的个数比加入所述培养基1，所述饲养细胞和所述经所述培养基1培养的人NK细胞按照10∶1的个数比加入所述培养基2，所述饲养细胞和所述经所述培养基2培养的人NK细胞按照10∶1的个数比加入所述培养基3。

10.根据权利要求8和9所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述培养的条件均为35℃-37℃、空气中CO₂体积含量为4.0％-10.0％和CO₂流速为0.10L/min-0.25L/min；具体可为如下培养条件：所述温度为37℃，所述空气中CO₂体积含量为5.0％，所述CO₂流速为0.15L/min。