[发明专利]自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域中一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。

背景技术

20世纪70年代Kiessling和Herberman首次在小鼠体内发现了一种区别于T细胞杀伤特征的免疫细胞并将其命名为自然杀伤细胞(natural killer cell)(以下，本发明说明书中省略为“NK细胞”)。NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞，起源于骨髓来源的CD34⁺造血祖细胞，无需有抗体存在或预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。随着对NK细胞识别人类肿瘤分子机制研究的深入，以NK细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗引起重视并取得重大进展。目前有关NK细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等，并已取得显著成效。但如何在保证临床安全性的前提下提高NK细胞体外增殖效率和杀伤活性一直是科研工作者和临床医生共同探索研究的重点。

目前各类动物模型试验都已证明自体NK细胞过继性治疗是安全有效的，Alicie等报道应用自体NK细胞治疗多发性骨髓瘤模型的同源免疫活性小鼠(Alici E，Konstan-tinidis KV，Sutlu T，et al.Exp Hematol，2007，35(12)：1839-1846)，以及Siegler等将体外活化扩增的急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia AML)患者NK细胞对非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠模型中的自体AML芽细胞杀伤都证实这一点(Siegler U，Kalberer CP，Nowbakht P，et al.Leukemia，2005，19(12).2215-2222)。各种临床研究证明自体NK细胞治疗技术是一种安全有效的治疗肿瘤手段。2009年5月1日我国卫生部颁布《医疗技术临床应用管理办法》正式生效，批准在国内开展自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术并制定相应管理规范，使得探求一种安全有效的自体NK细胞体外活化扩增体系成为可能。

目前主要是从培养基和血清种类，细胞刺激因子，辅助饲养细胞等各方面探索NK细胞高效培养的捷径。体外NK细胞扩增培养体系中，常用培养基分别为CellGro SCGM，RPMI-1640培养基，无血清培养基(X-VIVO TM Serum-free Media)3大类。各培养基的使用效果证实CellGro SCGM培养基比RPMI-1640和X-Vivo10培养基能更有效支持NK细胞生长活化与扩增。SCGM培养基是德国Cell Gro公司研制的一种用于造血干细胞培养的专门培养基(含有一些人源或人基因重组蛋白质)，已通过欧洲药典委员会和欧洲药物治疗管理局认证，可以用于临床。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等细胞因子对NK细胞的活化与扩增非常重要，其中IL-15的作用尤为重要。IL-2是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，可以在24h反应期内提高NK杀伤活性并刺激其增殖。近期Strivastava等研究证实IL-15单独或联合IL-2使用通常会导致最低限度NK细胞扩增(Strivastava S，Lundqvist A，Childs RW.Cytotherapy，2008，10(8)：775-783)。大量研究证明细胞因子对NK细胞的活化和扩增是必要的，但是仅有细胞因子并不能刺激NK细胞达到最理想的增殖状态。Alici等在多发性骨髓瘤患者体外NK细胞扩增的研究中使用IL-2和OKT3作为其细胞刺激因子，细胞扩增明显(Alici E，Sutlu T，Bjork strand B，Gilljam M，et al.Blood，2008，111(6)：3155-3162)。另外绝大多数研究人员认为NK细胞持续增殖需要在细胞因子的基础上增加额外刺激信号，比如同种异体单核细胞、自体淋巴细胞、促分裂素活性淋巴细胞、脐血间充质干细胞等辅助饲养细胞。目前多采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作饲养细胞以提高NK细胞扩增倍数，但其安全性尚待探讨。

总体来说，目前的NK细胞扩增效果仍不能满足实际应用，且安全性较低，临床适用性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基和含有该专用培养基的产品。该自体NK细胞体外活化扩增培养的方法可有效提高NK细胞的扩增倍数及杀伤活性并增加其安全性，从而使该细胞达到了能应用于临床的细胞质量指标。