[发明专利]α1,3半乳糖基转移酶基因转染材料及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种α3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在于：包括α1，3半乳糖基转移酶基因质粒、用于装载该质粒的PEG偶联的纳米脂质体、以及通过所述PEG偶联在所述纳米脂质体上的Endoglin抗体分子；所述α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料中，各组份的质量比为：α1，3半乳糖基转移酶基因质粒∶PEG偶联的纳米脂质体∶Endoglin抗体分子＝(0.1～0.3)∶(8.8～13.2)∶(0.8～1.2)。

2.根据权利要求1所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在于：所述α1，3半乳糖基转移酶基因质粒为5.75kb真核表达质粒。

3.根据权利要求1所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在于：

所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体微粒的粒径为40～200nm；

所述Endoglin抗体分子为单克隆抗体或单链抗体，分子量为20～180k道尔顿；

所述PEG由下述聚乙二醇衍生物提供：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺PEG衍生物，PEG的分子量为1000～4000。

4.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备PEG修饰的磷脂薄层；

2)重悬所述磷脂薄层，加入α1，3半乳糖基转移酶基因质粒，制得装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒；

3)对所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒进行均一化和纯化；

4)巯基化Endoglin抗体分子；

5)将所述巯基化的Endoglin抗体分子偶联在所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒上，得所述α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料。

5.根据权利要求4所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的具体步骤包括：用三氯甲烷将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺分别配制成20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和10mg/mL的相应浓度，并按摩尔比(90～100)∶(2～4)∶(2～4)∶1的比例在样品瓶中进行混合；充分混匀后，通以时间不少于10min的氮气流除去有机溶剂，并不断旋转样品瓶，直至形成PEG修饰的磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。

6.根据权利要求4所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的具体步骤包括：往步骤1)所述样品瓶中加入50mM、pH＝7.0的TRIS-HCl缓冲液，该缓冲液与所述步骤1)所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(10～250)∶1，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬所述步骤1)获得的PEG修饰的磷脂薄层，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入α1，3GT基因质粒、浓度为35％～75％的乙醇和200mM的CaCl₂溶液，并使α1，3GT基因质粒与所述步骤1)所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(0.1～0.3)∶(8.8～13.2)、乙醇的终浓度达到体积分数为35～40％、CaCl₂的终浓度达到4mM；将瓶盖旋紧并密封，进行7～12个循环的反复冻融，得到脂质体颗粒，其中，每一个冻融循环包括5～10min液氮-2～5min 37℃水浴-4～7min室温静置。

7.根据权利要求4所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的具体步骤包括：将步骤2)得到的脂质体颗粒依次通过膜挤出器中的400nm、100nm和50nm双层微孔滤膜各15～25次；在HEPES缓冲液中透析2～4h回收得到的脂质体颗粒，期间更换透析液一次。

8.根据权利要求4所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的具体步骤包括：将Endoglin抗体与10mM的Traut’s试剂在避光室温巯基化反应1～2h，其中所述Endoglin抗体与所述Traut’s试剂质量比为1∶(100～160)，随后超滤2～4次，除去Traut’s试剂的同时，将缓冲液置换成HEPES缓冲液。