[发明专利]白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法

权利要求书

1.白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括两种浓度FITC或两种浓度Alexa Fluor 488荧光标记的微球、融合蛋白捕获抗体、融合蛋白报道抗体、同型对照抗体、PE荧光标记的二抗、缓冲液和流式细胞仪检测，其特点在于以包被融合蛋白捕获抗体的一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球₁、包被同型对照抗体的另一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球₂组建检测白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列，流式细胞仪检测阵列所得微球₁的PE荧光强度与微球₂的PE荧光强度的二者比值为融合蛋白表达值。

2.如权利要求1所述的白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，包括步骤如下：

(1)利用现有技术抽提白血病细胞内融合蛋白；

(2)二元流式液相阵列的组建：

10000～100000个一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球₁加入到96孔微孔滤膜板well_a中，10000～100000个另一种浓度的FITC或Alexa Fluor 488荧光标记的微球₂加入到96孔微孔滤膜板well_b中，200μL MES缓冲液(pH 6.0)洗涤微球₁和微球₂各2次，真空抽滤收集微球；含微球的well_a和well_b孔中再分别加入含0.0001～0.01g Sulfo-NHS和0.0001～0.01g EDC的200μLMES缓冲液(pH 6.0)，混匀、室温、振荡、避光孵育20分钟；再将微球₁、微球₂分别用200μL PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤2次，真空抽滤收集微球；含微球₁的well_a孔中加入1～50μg融合蛋白捕获抗体，含微球₂的well_b孔中加入1～50μg同型对照抗体，well_a和well_b孔再分别加入PBS缓冲液(pH7.2)补充体积至200μL并混匀，避光、4℃孵育2小时；得包被融合蛋白捕获抗体的微球₁和包被同型对照抗体的微球₂；

(3)白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测，选自下列方案之一：

方案1：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板well_c孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球₁与微球₂各1000～10000个混合并加入到well_c孔中，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，再加入0.1～10μg融合蛋白报道抗体，混匀、避光室温孵育1小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL的PBS-2％BSA溶液中，加入0.1～10μg PE荧光标记的二抗，混匀、避光室温孵育30分钟；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，用流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 versus PE点图检测微球₁和微球₂PE荧光强度；

方案2：将步骤(1)制备的0.5～50μL白血病细胞内融合蛋白抽提液加入到96孔微孔滤膜板well_c孔中，再将步骤(2)制备的包被抗体的微球₁与微球₂各1000～10000个混合并加入到well_c孔中，加入0.1～10μg PE荧光标记的融合蛋白报道抗体，加入PBS-2％BSA溶液补足体积至150μL，混匀、室温、避光孵育2小时；将所得微球洗涤2次并重悬于100μL鞘液中，用流式细胞仪以FITC或Alexa Fluor 488 vers PE点图检测微球₁和微球₂PE荧光强度；

(4)按以下公式计算得白血病细胞内融合蛋白定量数据：

白血病细胞内融合蛋白表达值＝微球₁的PE荧光强度÷微球₂的PE荧光强度，或微球₂的PE荧光强度÷微球₁的PE荧光强度。