[发明专利]白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白血病细胞内融合蛋白的检测方法。

背景技术

流式液相阵列(又称流式微球阵列)是能保证信息质量和提供相对高通量的分子探测平台，与其技术原理相同的液相芯片技术是美国FDA2001年批准的首个临床型阵列分析技术。流式液相阵列中，微球锚定的捕获分子(抗体或核酸探针)捕获靶点分子，荧光标记的报道分子(抗体或核酸探针)报道靶点分子，一种或几种不同浓度荧光编码的微球组建阵列即可进行多参数并行分析。阵列解码常用生物医学工程仪器流式细胞仪或专用液相芯片仪。流式液相阵列具有灵敏度高、特异性强、数据图像化及多任务定量的显著优点。

流式液相阵列已广泛应用于分子诊断、药物发现、检验检疫、免疫技术和细胞学等领域。以荧光编码微球和核酸探针构建的流式液相阵列可以实施白血病诊断和微小残留病监测；基于流式液相阵列的分子结合分析能够同步筛选配基竞争性和ATP竞争性受体酪氨酸激酶拮抗剂，“敲除”药物抵抗先导物，避免放射法污染，可以快速、准确、有效地发现抗肿瘤先导药物；此外探测细胞信号通路传导的流式液相阵列也见诸报道。相比其它生物分子检测手段，基于荧光编码微球的流式液相阵列和液相芯片具有下述突出优点：(1)相对高通量。可以并行检测多个参数；(2)灵敏度高。检测下限约为10pg/mL；(3)微量检测。所需样本少，特别是临床检验只需几微升血液样品，即可快速完成多个并行临床参数检测。

白血病存在因染色体畸变而产生的融合基因和融合蛋白，异常染色体、融合基因和融合蛋白分别是白血病细胞生物学和分子生物学特异性标志。目前白血病细胞内融合蛋白表达水平常用的检测方法为逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、定量聚合酶链反应(quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR)、细胞遗传学、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和单群微球流式分析。研究表明，RT-PCR技术简易，但检测的是mRNA逆转录cDNA拷贝，易受反应条件影响，产生假阴性或假阳性结果；Q-PCR检测敏感性超过10^-4，达到10^-5分子水平缓解标准，但只有管家基因mRNA拷贝数高于2.5x10⁵，结果才有效；染色体核型分析数目少，定量困难；非流式FISH技术3％左右的假阳性率过高，不适用于白血病细胞内融合蛋白表达检测；白血病细胞内融合蛋白的单群微球流式分析方法变异系数大。

发明内容

针对现有检测方法的不足，本发明提供了一种白血病细胞内融合蛋白的二元流式液相阵列检测方法，可以快速、准确地检测白血病细胞内融合蛋白含量。

术语说明：

FITC：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)；

Alexa Fluor 488荧光：一种荧光染料的商品名称，本领域公知产品；

Sulfo-NHS：N一羟基硫代琥珀酰亚胺；

EDC：碳二亚胺；

MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate，简称MES

PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)；

PE：藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)；

PBS-2％BSA溶液：含2％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)；

AEBSF：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride，简称AEBSF；

well_a：a孔；

well_b：b孔；

well_c：c孔；

HBSS’s液：Hank’s平衡盐溶液，Hank’s balanced salt solution，简称HBSS’s液。

本发明的技术方案如下：