[发明专利]环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物及检测多重耐药cfr基因的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，其特征在于包括一对外引物，一对内引物和一个环引物，引物核苷酸序列如下：

外引物F3：5’-TCTTGAGCATGCAAACGA-3’，

外引物B3：5’-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3’，

内引物FIP：5’-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3’，

内引物BIP：5’-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3’，

环引物L：5’-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3’，

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

2.一种检测多重耐药cfr基因的试剂盒，其特征是包括若干个装有反应液的LAMP反应管， 

其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物L、余量为灭菌双蒸水；其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH4）₂SO₄、0.2wt% Tween20、1.6 M甜菜碱、2.8 mM dNTP。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括1 μL钙黄绿素。

4.一种检测多重耐药cfr基因的检测方法，其特征是包括以下步骤：

（1）提取待检细菌基因组总DNA；

（2）使用权利要求2或3所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有多重耐药cfr基因的松鼠葡萄球菌基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水，将LAMP反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：63℃水浴恒温反应35 min。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300 ng/μL的DNA溶液。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是LAMP反应管中出现白色沉淀为阳性结果，不出现白色沉淀为阴性结果。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是在扩增反应前的反应管中加入1 μL钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。