[发明专利]环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物及检测多重耐药cfr基因的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域    

本发明属于细菌基因检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，还涉及一种用环介导等温扩增方法检测多重耐药cfr基因的试剂盒，还涉及用环介导等温扩增方法检测多重耐药cfr基因的检测方法。

背景技术   

近年来由于广谱抗生素的广泛应用和不合理使用，使得细菌的耐药性愈来愈强，出现了大量的多重耐药菌株（MDRO）。目前常见的包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的细菌（如大肠杆菌、克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌等）和多重耐药的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等。这些耐药菌株分布广，传播快，容易产生暴发流行，对临床普遍使用的多种抗菌药物耐药，给临床治疗及医院感染控制带来困难。

Cfr基因是从革兰氏阳性菌发现的第一个可介导氯霉素、氟苯尼考耐药的23S rRNA甲基化酶，具有多耐药的表型，可同时介导对氯霉素，林可霉胺类，恶唑烷酮类，链阳菌素A和截短侧耳素类等五类药物的耐药，因此具有cfr基因的细菌有着明显的进化优势。Cfr基因合成的蛋白质在细菌耐抗生素机制中发挥重要作用，它能很容易从非人类病原体传播给其他能感染人的细菌类型，可感染多种耐抗生素细菌。

对于具有cfr基因多重耐药菌的实验室诊断主要基于抗药性表型检测和PCR技术进行基因确证。但由于PCR具有易出现假阳性，检测成本高，操作比较复杂，且检测时间长，一般需要2~3小时，影响到临床携带多重耐药cfr基因的检测结果。

发明内容   

为了解决PCR扩增易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，填补使用LAMP检测多重耐药cfr基因的空白，本发明提供了用环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物。本发明建立了一种多重耐药cfr基因LAMP检测方法，根据多重耐药cfr基因保守区的6段序列设计了一对特异性内引物，一对特异性外引物和一个环引物。

本发明还提供了检测多重耐药cfr基因的试剂盒。

本发明还提供了检测多重耐药cfr基因的检测方法。

本发明是通过以下措施实现的：

一种环介导等温扩增多重耐药cfr基因的引物，包括一对外引物，一对内引物和一个环引物，引物核苷酸序列如下：

外引物F3：5’-TCTTGAGCATGCAAACGA-3’，

外引物B3：5’-TCAATATCAATCCCAAATTGACT-3’，

内引物FIP：5’-TGCACTTATTGTAGGATTGTATCGTGTTGTTAGCCTTCTTAAAAGTCG-3’，

内引物BIP：5’-CCTGAGATGTATGGAGAAGCAAACAATTGTGACATGGATACCAGC-3’，

环引物L：5’-GAAGGGCAGGTAGAAGCCT-3’。

其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。

一种检测多重耐药cfr基因的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管， 

其中，每25 μL反应液中含有：12.5 μL 2×等温反应缓冲液、1.0 μL Bst DNA聚合酶、40 pmol内引物FIP、40 pmol内引物BIP、5 pmol外引物F3、5 pmol外引物B3、20 pmol 环引物L、余量为灭菌双蒸水；

其中，Bst DNA聚合酶的活性单位为8U/μL；

2×等温反应缓冲液中含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH4）₂SO₄、0.2wt% Tween20、1.6 M甜菜碱、2.8 mM dNTP。

所述的试剂盒，还包括1 μL钙黄绿素。

一种检测多重耐药cfr基因的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检细菌基因组总DNA；