[发明专利]一种分离纯化达托霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及达托霉素的制备方法，具体的说涉及一种采用陶瓷膜过滤、树脂层析以及结晶技术制备高纯度达托霉素的方法。

背景技术

随着抗生素的发展及抗生素的滥用，病原菌对抗生素的耐药性是当今社会面临的最严峻挑战。除了控制抗生素滥用外，目前寻找一种有效的对抗耐药菌的抗生素成了解决这一问题的最佳途径，万古霉素曾被认为是对抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，但现在全世界临床已发现越来越多的耐此药菌。

达托霉素(Daptomycin)是由Lilly(礼来)公司最初研究，Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。

达托霉素虽然已经在美国实现工业化生产，但在中国并未实现规模生产，其主要原因在于没有能够实现工业化的提取技术。

现有的达托霉素提取方法，例如中国专利申请200910058577.7所描述的达托霉素提取方法，仅采用大孔树脂分离纯化达托霉素，所得的达托霉素色谱纯度仅为80％-90％，不但不能满足制药需求，而且因为其成本高昂而无法实现工业化生产。中国专利申请200910085837.X虽然采用离子交换树脂方法获得高纯度的达托霉素，但是因存在达托霉素被严重破坏的问题而无法实现分离纯化达托霉素的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉同时又能制得高纯度达托霉素的制备方法。其包括如下步骤：

1)将达托霉素发酵液调节pH2.0-4.5后，用膜孔径为0.01μm-0.1μm的陶瓷膜进行过滤，然后用pH2.0-4.0的酸性水溶液循环洗涤陶瓷膜，弃滤液，再用pH8-10的碱性水溶液循环洗涤陶瓷膜，收集达托霉素滤液；

2)将步骤1)所得达托霉素滤液调节pH4.5-7.0，经弱碱性阴离子交换树脂吸附、洗脱后得到达托霉素解吸液；

3)将步骤2)所得达托霉素解吸液经大孔吸附树脂吸附、解吸脱色后得达托霉素脱色液；

4)将步骤3)所得达托霉素脱色液经截留分子量为50-500的纳滤膜系统浓缩，得到达托霉素浓缩液；

5)将步骤4)所得达托霉素浓缩液调节pH5.0-7.0，然后加入无机钙盐和醇类溶剂进行结晶，晶体过滤干燥后得到固体达托霉素。

上述步骤1)中，首先将发酵液pH调至2.0-4.5，由于达托霉素等电点为PI3.5，在pH2.0-4.5的条件下，达托霉素形成分子量很大的胶束，不会透过陶瓷膜。洗涤所用的pH2.0-4.0酸性水溶液可以采用磷酸溶液，其用量通常是发酵液体积的1-2倍；所述碱性水溶液可以是pH8-10的氢氧化钠或氢氧化钾溶液，其用量以发酵液体积的4-5倍为宜。洗涤完后，达托霉素的收率在92％以上。

上述步骤2)采用弱碱性阴离子交换树脂分离系统分离纯化达托霉素，优选D301树脂，D301树脂价格便宜，成本低，而且它对达托霉素的选择性较强。D301树脂的装填内径和高度比一般为1∶5～1∶7，优选为1∶6。洗脱液可采用pH5.5-6.0的NaCl溶液。

上述步骤3)采用大孔树脂分离系统进一步分离纯化达托霉素，优选为HZ20树脂，这种树脂价格便宜，颗粒较粗，不易造成堵塞。HZ20树脂的装填内径和高度比一般为1∶5～1∶7，优选为1∶6。用大孔树脂吸附达托霉素后，可先用15％-20％乙醇溶液清洗大孔树脂，再用30％-35％的乙醇溶液将达托霉素洗脱下来。

上述步骤4)纳滤膜的截留分子量优选为100-200。

上述步骤5)无机钙盐的加入量以浓缩液中所含达托霉素质量的30％～50％为宜，所述无机钙盐例如氯化钙、乙酸钙。所述醇类溶剂常用的有乙醇和异丙醇，其加入量通常是浓缩液体积的3-6倍。

上述各步骤，一般的，采用磷酸、乙酸和氢氧化钠来调节溶液的pH。