[发明专利]一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物免疫细胞的纯化领域，特别涉及一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法。

背景技术

双壳贝类的循环系统属于开放式，心脏被一个薄而透明的围心腔膜所包围，静脉窦中含有大量的血液，在外套膜上有一个大的血管系统，致密的血管网几乎布满于整个外套膜上，所以，当刺破闭壳肌及外套膜后，大量血液渗出汇集在外套腔内。贝类参与细胞免疫的细胞为血细胞，它是贝类体内抵御外来病原微生物侵袭的主要屏障，血细胞通过参与包埋、吞噬、结节形成，细胞凝块和伤口修复等过程起到免疫防御作用。

近年来，随着贝类养殖规模的扩大，贝类病害日益严重，给中国的贝类养殖业造成了重大经济损失。所以研究贝类免疫学，特别是贝类血细胞的研究，以解决贝类养殖中发生的病害问题已成为研究的热点，这些研究需要获得大量纯净的贝类血淋巴。

现有的采血方法是找到贝类的围心腔，直接用一次性注射器插入围心腔抽取血液，但这种采血方法存在很多弊端：其一，取血量少；其二，所取血液中含有很多粘液和杂质，所获得的血细胞不纯。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法，该方法操作简单，对设备要求低，可能获得大量纯净血细胞。

本发明的一种海洋双壳贝类血细胞的纯化方法，包括：

(1)将新鲜的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合，得混合液；

(2)将上述的混合液过滤，自然沉降，然后出除表层；再进行离心，去除上清液，最后用PBS洗两次，重悬血细胞，即得。

步骤(1)中所述的海洋双壳贝类为菲律宾蛤仔、文蛤、青蛤、缢蛏、泥蚶、彩虹明樱蛤或扇贝等海洋双壳贝类。

步骤(1)中所述抗凝剂的配方为将NaCl 8g，Na₂HPO₄ 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g溶于1000ml蒸馏水，然后加EDTA 5g，60℃下加热搅拌即得。

步骤(1)中所述的海洋双壳贝类血液与抗凝剂混合为按照体积比1∶1混合。

步骤(3)中所述的过滤为将混合液经双层300目筛绢过滤。

步骤(3)中所述的自然沉降的条件为于4℃静置12h。

步骤(3)中所述的去除表层为用移液枪将表层4ml吸去。

步骤(3)中所述的离心为于4℃离心20min，转速为300×g(该转速下，大部分贝类血细胞在不破碎的情况下均能沉降)。

步骤(3)中PBS洗两次时于4℃离心5min，转速为300×g(低温能保证血细胞内酶活，离心5min后，贝类血细胞基本沉降，碎片及杂质悬浮于pbs中)；重悬血细胞中血细胞浓度约为10⁶cells/ml。

本发明中所采用的新鲜海洋双壳贝类血液可以用多种方法采集，其中一种优选的采集方式为：

a：暂养：根据不同双壳贝类的生活习性，在其适宜温度和盐度的过滤海水中暂养24h；

b：消毒及开壳：将贝类贝壳、单面刀片用75％酒精消毒后再用消毒海水冲洗三次，确定闭壳肌的位置，用单面刀片插入两贝壳之间，轻轻划贝类的闭壳肌，使贝壳可自由开合；

c：采血：划开后血液汇集在贝壳的外套腔内，用一次性滴管吸取贝类血液，避免吸到其它杂质，持续吸取，直至无大量血液留出。

本方法简单易行，毋需增加仪器设备，可对海洋双壳贝类进行血细胞采集，为贝类血细胞的研究提供了切实有效的技术手段。

本发明改良了抗凝剂的配方，并对血液进行纯化，解决了贝类血细胞研究过程中血细胞杂质多的问题，对获得大量纯净的血细胞有显著效果。

有益效果：

与现有技术相比较，本发明的优点在于：

(1)本发明方法操作简单，对设备要求低，可能获得大量纯净血细胞

(2)本发明适用于所有海洋双壳贝类，优选为菲律宾蛤仔、文蛤、青蛤、缢蛏、泥蚶、彩虹明樱蛤、扇贝；

(3)本发明中将吸取到的贝类血液与抗凝剂的混合液经过滤、静置、离心、重悬后，使所得到血细胞更加纯净；

(4)本发明采用改良的抗凝剂配方，使获得的血细胞不出现凝集反应，得到的血细胞形态良好。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。