[发明专利]利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用

权利要求书

1.用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的基因特异引物(GSP)，是在待鉴定基因的已知剪接变体的全长cDNA序列范围内寻找可能的候选引物区域，并以DNA杂交探针兼容反转录引物的形式设计出3’GSP，然后将设计好的3’GSP直接用于反转录和巢式PCR反应，用以挖掘低丰度表达基因和系统鉴定基因的可变剪接变体。

2.根据权利要求1所述的基因特异引物(GSP)，其特征在于：所述基因特异引物(GSP)的设计由Primer3程序自动完成，程序设计主要思路如下：

1)从NCBI GenBank数据库中获取某一基因剪接变体的序列，并根据GenBank数据库记录或使用splign、gmap、blat、blast等软件解析其基因结构；

2)在全长cDNA序列范围内寻找可能的候选引物区域；

3)为候选引物打分，由三个部分组成，即S＝S_basic+S_end+S_genome：

a)引物质量基本分数(S_basic)：按照常规引物质量评估体系打分，即引物长度18～25bp、GC含量约50％、Tm约58℃，与这些参数越接近的引物打分越高；

b)引物与基因两端距离分数(S_end)：按照GSP的要求，即越靠近两端打分越高，针对5’GSP和3’GSP分别打分；

c)全基因组引物特异性控制分数(S_genome)：从热力学的角度全基因组扫描可能的引物靶定位点，位点越少(除靶基因之外)打分越高；

4)按照打分情况排序候选引物，并取打分最高的前5条引物(备选)作为用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的引物。

3.根据权利要求1或2所述的基因特异引物(GSP)，其特征在于：所述步骤4)中通常提供前5条引物备选，如果经过筛选之后，不能获得5条备选引物，那么则根据实际情况降低引物筛选标准，选择前1-4条引物作为备选即可；针对野生型秀丽隐杆线虫N₂株系的glb-18基因的已知剪接变体设计的5’GSP1具有序列表中序列1的核苷酸序列，3’GSP1具有序列表中序列2的核苷酸序列，3’GSP2具有序列表中序列3的核苷酸序列，3’GSP3具有序列表中序列4的核苷酸序列；针对小鼠BDNF基因的已知剪接变体设计的5’GSP5具有序列表中序列5的核苷酸序列，5’GSP6具有序列表中序列6的核苷酸序列，3’GSP4具有序列表中序列7的核苷酸序列。

4.一种利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法，其特征在于：该方法利用了巢式PCR结合权利要求1-3任一项所述基因特异引物(GSP)的反转录技术。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述利用巢式PCR结合基因特异引物(GSP)的反转录技术，是由不同丰度基因的基因特异引物(GSP)直接参与反转录，继而进行巢式PCR的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)基于3’GSP1的反转录PCR；

2)利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度；

3)基于GSP的巢式PCR；

4)测序；

5)基于生物信息学的序列结果分析，判定是否为新的剪接变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中基于3’GSP1的20μl反转录体系及反转录方法为：(1).总RNA 1μg，对应基因10pmol/L 3’GSP1 1μl，RNase Free H₂O补齐至12μl，混匀后，65℃5min，然后立即置于冰上；(2).5×RT buffer 4μl，dNTP Mixture 2μl，RNase inhibitor 1μl，反转录酶1μl；将(1)和(2)中溶液混匀后按以下程序进行反转录：先30℃10min，然后40℃40min，再85℃5min，最后4℃停止。