[发明专利]利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，特别是涉及一种利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法，该方法可应用在不同环境下低丰度表达基因以及可变剪接变体表达的相关研究和评估中。 

背景技术

研究报道，高等真核生物约有95％的基因发生可变剪接。基因在特定环境下表达特定的剪接形式，后者往往是某些疾病的生物标记，也可能是导致这些疾病的原因，因此尽可能多地发现重要基因的可变剪接形式在生物学和医学研究方面意义重大。但是，由于某些基因的转录本丰度异常低，这就给在组织特定阶段、生理或病理条件下确定特异剪接变体的种类以及特殊转录本的外显子组成带来了一定的困难。同时，越来越多的证据表明低丰度表达基因在重要生物过程中起着举足轻重的作用，例如低丰度表达基因剪接变体与细胞分化、新陈代谢和表型改变等有着密切的关系，并且可能是生物进化过程中的一个重要驱动力，然而由于低丰度表达基因的低转录本和高异质性，导致人们对于低丰度表达基因转录本的认识还处于一个初始阶段。 

为了深入认识低丰度表达基因的结构和功能，目前已发展了多种技术方法来寻找和鉴定低丰度表达基因及其剪接变体，主要包括表达序列标签(EST)预测、基因表达的序列分析(SAGE)、RNA-Seq预测、mRNA差异显示PCR(DD-PCR)、代表性差异分析(RDA)、酶降解消减、接头捕获消减、物理移除共同序列、差异消减展示(DSD)、限制性标记cDNA扫描、靶长链多态性标记消减、抑制消减杂交(SSH)、cDNA末端快速扩增(RACE)、SMART-RACE和实时定量PCR等技术。这些技术虽然能够在一定程度上获取低丰度表达基因，但又存在其自身的缺点，如假阳性高、稳定性差、步骤繁琐、工作量大、周期长、成本过高等，使其难以普遍推广应用，因而目前尚无挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的有效方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的基 因特异引物(gene-specific primer，GSP)。 

本发明所提供的基因特异引物(GSP)，是由引物设计软件或其它类似功能的引物设计软件设计完成，基因特异引物(GSP)包括3’GSP(靠近3’端)和5’GSP(靠近5’端)，并且要求尽量靠近两端。除了一般PCR的引物所必须具备的条件之外，基因特异引物(GSP)还需在热力学特征上满足基因特异性(非单纯序列比对水平)的要求。 

用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定基因的不同剪接变体的基因特异引物(GSP)是在待鉴定基因的已知剪接变体所对应的全长cDNA序列范围内，寻找可能的候选引物区域，并以DNA杂交探针(hybridization probe)和反转录引物的形式设计出3’GSP，然后将设计好的3’GSP直接用于反转录过程和巢式PCR反应，用以挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体。 

具体来讲，所述基因特异引物(GSP)的设计由Primer3程序自动完成，程序设计主要思路如下： 

1)从NCBI GenBank数据库中获取某一基因剪接变体的序列，并根据GenBank数据库记录或使用splign、gmap、blat、blast等软件解析其基因结构； 

2)在全长cDNA序列范围内寻找可能的候选引物区域； 

3)为候选引物打分(Score)，由三个部分组成，即S＝S_basic+S_end+S_genome； 

a)引物质量基本分数(S_basic)：按照常规引物质量评估体系进行打分，即引物长度为18～25bp、GC含量约50％、Tm约58℃，与这些参数越接近的引物打分越高； 

b)引物与基因两端距离分数(S_end)：按照GSP的要求，即越靠近两端打分越高，针对5’GSP和3’GSP分别打分； 

c)全基因组引物特异性控制分数(S_genome)：从热力学的角度全基因组扫描可能的引物靶定位点，位点越少(除靶基因之外)打分越高； 

4)按照打分情况排序候选引物，并取打分最高的前5条引物作为用于挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的引物。