[发明专利]一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法和应用。

背景技术

我国为丙型肝炎(HCV)的高发区，约有5000万感染者，占到全球40％的份额。丙肝是肝硬化及肝癌的主要原因，在输血等治疗中有极高的传染率。公众对丙肝认知水平也较低，在83％的有丙肝高危险人群中，仅有5％检测过丙肝。目前既没有非常明确的药物，也缺少有效的疫苗加以预防和阻止其进一步传播。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV的传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义，其中HCV的血源筛查是控制丙肝蔓延的最重要手段和政府高度重视的措施。

丙型肝炎发病缓慢、迁延，血液中病毒滴度极低，对于检测技术灵敏度要求较高。HCV的Core和NS3蛋白含有较强的优势抗原表位，其相应的抗体出现早/阳性率高，能够有效的满足血源筛查的需求，是目前第二代、第三代HCV免疫诊断的重要成分。J.A.NEVILLE et al (1997)Journal of Clinical Microbiology 35：3062；Maaritet al(2009)Virology Journal6：84。当前强生分公司Ortho和Abott公司HCV诊断试剂中，所用到的Core蛋白和NS3蛋白，各自由大肠杆菌和酵母表达系统分别表达。

国内一些研究将Core蛋白和NS3蛋白串联表达，所得重组抗原可以有效的检测出血清中的HCV抗体，能够满足检测需求。李暐东等，(2000)中国病毒学15：204；宋晓国等，(2001)军事医学科学院院刊25：91；CN200410066472.3，CN200780007977.4，CN200910260058.9。这些文献所公开的丙肝融合蛋白的制备方法，均是通过常规的分子生物学手段，将目的基因构建至一定的载体中进行表达。

Core、NS3蛋白两者联合表达对大肠杆菌有一定的细胞毒性，并且产物容易被大肠杆菌中的蛋白酶所降解，用上述公开的常规分子生物学手段进行目的蛋白表达时，产品得率低、均一性差，为下游的分离纯化带来困难，并且所获抗原用以Elisa检测时，本底值较高，容易引起结果的误判。

本发明选取HCV中的Core蛋白和/或NS3蛋白中的优势抗原表位进行串联表达，构建目的蛋白，并且在上述目的蛋白的N端，引入寡聚(PDDDDPG)结构调节融合蛋白等电点，促进包涵体形成，以避免目标蛋白的细胞毒性及大肠杆菌蛋白酶对目标蛋白的降解。考虑到后续纯化工艺，在寡聚结构后引入Xa因子酶切位点(IEGR)，在目的蛋白C末端后，添加His标签。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法。

本发明的另一个目的就是提供优化的重组丙肝抗原Core和/或NS3的编码序列和重组丙肝抗原的获得，以及用于该方法的表达载体及工程菌株。

由此提供下述发明：

一种高效表达重组丙型肝炎病毒多表位抗原的方法，包含丙肝病毒Core蛋白和/或NS3蛋白，其特征在于，上述目的蛋白的N端引入寡聚(PDDDDPG)_m结构调节融合蛋白等电点，寡聚结构后连接Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签。

根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，包含Core蛋白和/或NS3蛋白优势抗原片段，Core蛋白源自如如SEQ ID NO.1所述的天然Core蛋白，NS3蛋白片段源自如SEQ ID NO.2所述的天然NS3蛋白。

根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的目的蛋白，N端引入寡聚(PDDDDPG)_m，寡聚结构后连接Xa因子酶切位点(IEGR)，目的蛋白C末端添加有His标签，即从N末端至C末端为(PDDDDPG)_m-IEGR-Core-NS3-His6，其中m表示(PDDDDPG)的重复单元数。

根据本发明任意一项所述的重组丙型肝炎病毒多表位抗原，其中所述的Core蛋白征段源自如SEQ ID NO.1所述的天然Core蛋白，所述Core蛋白片段，经至少如下方式修饰：

a.RKTKRNTNRRPE(9-20残基)；

b.KDRRSTGKAWGKPGRPWPLYGNEGL(67-91残基)

c.HRSRNVGKVIDTLTCGFADLMGYIPVV(114-140残基)