[发明专利]使用腈水解酶突变体生产3-羟基羧酸

说明书

本申请是申请日为2005年8月16日的中国专利申请200580035301.7“使用腈水解酶突变体生产3-羟基羧酸”的分案申请。

本申请要求2004年8月16日提交的美国非临时申请第10/919182号的利益。

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域。更具体地说，本发明涉及具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，所述腈水解酶用于将3-羟基腈转化为3-羟基羧酸。

背景技术

具有优异性能、独特性质、改善的成本效率、品质以及低生态影响的新聚合物正引起工业界的注意。特别是，需要具有支链、致密结构以及末端带反应基的功能聚合物，因为与常规线型统计共聚物相比，它们具有更低的特性粘度和更高的活性。

这样优异的聚合物可通过共聚高支化(hyperbranching)羟基羧酸共聚单体(高支化AB_n型，其中A和B是具有羟基或羧基衍生的反应基部分，n是2或更大)(Hult等，pp.656-658和Voit等，pp.658-659 in Concise Polymeric Materials Encyclopedia，编辑.J.C.Salomone，CRC Press，New York，1999)和多种线型羟基羧酸共聚单体(线型AB型)包括3-羟基戊酸(3-HVA)和3-羟基丁酸(3-HBA)得以制备。

3-羟基羧酸用作为共聚单体用于制造线型聚酯。聚酯被用作为热塑性、热固性、半结晶、非晶形、刚性和弹性体材料。它们是纤维、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman，pp.793-799 in Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，编辑.J.I.Kroschwitz，John Wiley & Sons，New York，1990)。

已在使用皱落假丝酵母(Candida rugosa)的发酵中通过戊酸的3-羟基化作用制备了3-羟基戊酸(Hasegawa等，J.Ferment.Technol.59：257-262(1981)；JP 59053838 B4)，并且通过使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)和Arthrobacter crystallopietes，经发酵的戊酸的3-羟基化作用，类似地制备了3-羟基戊酸的单一对映体(U.S.3,553,081)。这些用于戊酸发酵氧化的方法通常产生低产物浓度的3-羟基戊酸，并且从发酵培养基中分离3-羟基戊酸需要精心设计且费用昂贵。已通过化学降解(Seebach等，HeIv.CMm.Acta 77：2007-2034(1994))或聚(3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯)发酵自降解(WO 9929889)制备得到(R)-(-)-3-羟基戊酸，但是羟基丁酸/羟基戊酸共聚物的降解同样需要费力地将3-羟基丁酸与副产物3-羟基戊酸分离。还已通过酶促还原3-氧代戊酸(Bayer等，Appl.Microbiol.Biotechnol.42：543-547(1994))或不对称氢化甲基3-氧代戊酸酯接着皂化(Burk等，Organometallics 9：2653-2655(1990))制备得到(R)-(-)-3-羟基戊酸。

通过多种化学方法，腈容易地转化为相应的羧酸。这些方法需要强的酸性和碱性反应条件和高反应温度，且通常产生不需要的副产物和/或作为不需要的废弃物的大量无机盐。用于化学水解额外具有羟基的腈的反应条件，例如用于将3-羟基戊腈转化为3-羟基戊酸的反应条件，通常会导致不期望的伯、仲或叔羟基消除，产生碳-碳双键。