[发明专利]三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法

权利要求书

1.三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法，其特征在于：是同时检测烟草普通花叶病毒、马铃薯Y病毒和黄瓜花叶病毒的方法，该方法包括甄别比对病毒基因组中保守区域，人工筛选合成适用于三种病毒病复合RT-PCR特异性引物；分析获得TMV、PVY、CMV侵染烟叶样本；整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，建立基于一步法RT-PCR复合检测烟叶感染TMV、PVY、CMV的方法。

2.根据权利要求1所述的三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法，具体步骤如下：

（1）三种病毒特异性核苷酸引物设计与合成

使用DNAMAN6.0软件，对GenBank收录的TMV、PVY、CMV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列做比对，确定病毒序列中的相对保守区域，在选定的保守区域内使用Oligo 6.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物特异性；由于多重PCR要求各引物及引物对的退火温度尽量接近，同时扩增子的大小也应在琼脂糖凝胶电泳能够显著区分的情况下尽量相近，故最终选定TMV、PVY、CMV各一对引物，人工合成后用去RNase水溶解至工作浓度10μM；

TMV： 上游引物(TF1) 5’-TGTGTGCAAAACTTACTTCCC-3’ 

下游引物(TR1) 5’-AGGACAAAACATTTGCGTATG-3’ 

PVY： 上游引物(PF1) 5’-ACTGTGATGAATGGGCTTATG-3’ 

下游引物(PR1) 5’-GGCATATATGGTTCCTTTTTG-3’ 

CMV： 上游引物（C3F1）5’-GGCTTTCCAAGGTACCAGTAG-3’ 

下游引物（C3R1）5’-ATCGAGCTTGCCAATTACTAC-3’ 

（2）烟草总RNA的提取

首先血清学诊断试剂盒检测分析病毒感染烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY、CMV侵染的烟叶样品，取典型症状烟叶50mg，液氮中研成粉末，提取烟草总RNA，抽提产物溶于50μl无RNA酶污染的双蒸水中，-20℃贮存备用；

（3）三重一步法RT-PCR同时检测三种病毒反应条件的建立

本试验通过多个梯度性预试验，反复摸索和调整体系因素，最终获得了使所选的3对引物在同一RT-PCR反应管中正常反应的最佳条件，经过优化的反应体系为：10×PCR Buffer 7.5μl；Mg²⁺(25mM) 6μl；dNTP（2.5mM each） 4μl；Taq酶 4U；AMV反转录酶5U；Ribonuclease Inhibitor 10U；TMV上、下游引物各2μl，CMV上、下游引物各2μl，PVY上、下游引物各3μl；RNA 各500ng；去RNase水补足至50μl；反应条件：42℃反转录30min，95℃热失活5min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸70sec，30个循环；72℃补充延伸10min，扩增产物取5-10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

3.根据权利要求2所述的三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法，其特征在于：步骤（2）中使用Agdia公司TMV、PVY、CMV诊断试剂盒PathoScreen^RTMV、 PathoScreen^RPVY、PathoScreen^RCMV检测分析病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY、CMV侵染的烟叶样品。

4.根据权利要求2所述的三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法，其特征在于：在步骤（2）中采用RNeasy Plant Mini试剂盒提取烟草总RNA。

5.一种如权利要求1所述三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法所用引物，其特征在于：所述特异性引物为：

TMV： 上游引物(TF1) 5’-TGTGTGCAAAACTTACTTCCC-3’ 

下游引物(TR1) 5’-AGGACAAAACATTTGCGTATG-3’ 

PVY： 上游引物(PF1) 5’-ACTGTGATGAATGGGCTTATG-3’ 

下游引物(PR1) 5’-GGCATATATGGTTCCTTTTTG-3’ 

CMV： 上游引物（C3F1）5’-GGCTTTCCAAGGTACCAGTAG-3’ 

下游引物（C3R1）5’-ATCGAGCTTGCCAATTACTAC-3’ 。