[发明专利]三重一步法RT-PCR同时检测烟草上三种病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒病害检测技术领域，提供一种三重一步法RT-PCR同时检测烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus, TMV）、烟草马铃薯Y病毒（Potato Y virus, PVY）和烟草黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的方法，具体涉及针对三种烟草病毒特异性核苷酸引物序列的合成和该检测方法的有效建立。

背景技术

烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）、马铃薯Y病毒 （Potato virus Y, PVY）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）寄主范围广泛，主要危害烟草、番茄、黄瓜、马铃薯等多种经济作物和园艺作物。其地理分布极广，属于世界性病毒病害，世界各大洲的作物生产都曾因其导致的病毒病而受到重大损失。

以上三种病毒病是烟草上发生普遍、危害严重的重要病毒病害，减轻烟草农业生产中病毒病危害的关键是大面积推广培育应用无病毒壮苗、加强田间管理和采取有效地病毒防控技术措施。病毒检测监控是防控技术措施中的一个重要环节，针对烟草病毒病具有危害大、流行广、防治难的特点，尽快尽早建立快速、准确和高效的检测技术十分必要。目前大田烟草病毒病鉴定的方法主要有常规生物学检测、免疫学及分子生物学方法，但都存在不同程度的缺陷和不足。常规生物学检测费时费力，血清免疫学和分子生物学检测方法对制备病毒样品材料要求较高、易受实验条件的限制且费用昂贵。通常在实际病毒的分子生物学检测过程中，TMV、PVY、CMV等是单独鉴定的，重复性工作较多，费时费力成本较高。多重RT-PCR（Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction）是在一次反转录（RT）反应中加入多于1对的引物，首先对目的病毒核酸进行反转录，然后以此阶段合成的多个反转录产物（cDNA）为聚合酶链式反应（PCR）的模板，指数扩增获得相应一个以上病毒病原鉴定信息。由于烟草病毒多为混合侵染，症状表现复杂，利用单一RT-PCR多种病毒进行系统检测的工作量较大，与常规的单一RT-PCR相比，多重RT-PCR可以同时检测多种病毒或区分病毒的不同株系，可以明显地提高检测效率，降低检测成本，因而多重RT-PCR在烟草病毒检测中的优越性更为明显。同时检测两种或多种病毒的双重或多重RT-PCR技术的关键是要选用合适的引物，在保证引物特异性的前提下，避免引物之间的互作干扰。

多重RT-PCR在实际应用过程中，分为两个操作步骤来进行，首先对目的病毒核酸进行反转录（RT），然后以反转录产物（cDNA）为模板进行指数扩增获得相应病毒病原鉴定信息。两个反应步骤和阶段对应两个不同的反应体系，整个试验的影响因素较多，同时也加大了试验污染和人工误操作的几率。

 

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术不足而提供的三重一步法RT-PCR检测烟草上三种重要病毒的方法。根据TMV、PVY、CMV基因组序列保守区域分别设计合成一对特异性引物，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，成功建立了基于一步法RT-PCR同时检测烟叶感染TMV、PVY、CMV的方法。该技术方法的建立将为烟草农业生产过程中TMV、PVY、CMV的准确检测提供一种灵敏、快捷、特异而高通量的方法。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：三重一步法RT-PCR检测烟草普通花叶病毒、马铃薯Y病毒和黄瓜花叶病毒的方法。该方法包括甄别比对病毒基因组中保守区域，人工合成筛选适用于三种病毒病复合RT-PCR特异性引物；分析获得TMV、PVY、CMV侵染烟叶样本；整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，建立基于一步法RT-PCR复合检测烟叶感染TMV、PVY、CMV的方法。

具体步骤如下：

（1）三种病毒特异性核苷酸引物设计与合成