[发明专利]一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提纯子囊霉素的工艺，属于生物工程领域，具体涉及生物制药，发酵产物的提取、分离和纯化方法，特别涉及一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法。

背景技术

子囊霉素(Ascomycin，Immunomycin，FK-520)为二十三碳的大环内酯类化合物，是免疫抑制剂FK-506(他克莫司，tacrolimus)乙基类似物，40多年前日本藤泽制药公司从含有吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的土壤中分离得到。自从其结构类似物他克莫司的免疫抑制活性被发现后，迅速推动了子囊霉素及其衍生物的免疫抑制活性研究。研究发现子囊霉素具有很强的免疫抑制剂作用，目前子囊霉素已被用作生产半合成API(如吡美莫司)的中间体。吡美莫司是第一个被设计用于皮肤病的子囊霉素衍生物，由子囊霉素经缩环反应而形成。吡美莫司主要应用于特应性皮炎(AD)、变应性接触性皮炎、银屑病，红斑狼疮，扁平苔藓，白癜风，Nethenton综合症，移植物抗宿主病等自身免疫疾病的治疗。

近年来国内外主要选用以吸水链霉菌为代表的微生物发酵法来生产子囊霉素。1962年，日本藤泽制药公司首次从壤中分离的吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus No.KK317的发酵液中提取得到子囊霉素。特别是二十世纪八十年代末，Fujisawa及Abbott公司从吸水链霉菌变种的发酵液中发现了FR-900520和ATCC14891，它们在光谱、色谱、化学结构上与子囊霉素相同。2008年，匈牙利科学家Attila Kónya等从土壤中筛选到一株子囊霉素产生菌Streptomyces tubercidicus DSMZ42761，证实了非吸水链霉菌也能产生子囊霉素的事实。

国内对子囊霉素的研究尚处于起步阶段，中国专利CN101036649公开了子囊霉素作为免疫抑制剂在制备治疗自身免疫性糖尿病和皮肤抑制排斥反应的药物中的用途。昆明理工大学穆云龙通过对子囊霉素菌种选育及发酵条件的的初步研究，发酵培养96小时，发酵效价最高可达131.7mg/L。但对于如何分离提取产物并为具体说明。1988年日本藤泽制药公司报道提取子囊霉素的方法。由于发酵液中会存在多种子囊霉素类似物且由于子囊霉素在水相中存在异构现象，而提取分离方法中多含有水相，这就使得从发酵液中提纯子囊霉素主要技术研究存在较大技术难度。

目前对于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素发酵、子囊霉素衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面。现阶段子囊霉素分离提取的主要问题是子囊霉素的收率不高，分离成本高等问题。另外，由于子囊霉素在水相中存在异构现象，目前提取分离方法中多含有水相，产品中含有子囊霉素结构类似物，影响产品纯度及产品形态。而我国目前还未有子囊霉素工业化生产报道，其市场基本被日本和美国等国外公司占领。因此，本领域迫切需要提供一种生产成本低廉、适合于工业化生产的提纯子囊霉素的生产方法。

发明内容

本发明的目的是为了改进现有技术中存在的缺陷或不足，而提供了一种采用从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，操作方便、工艺简单、降低了成本、提高了效率，适合工业化生产。

本发明的技术方案如下：一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，其特征在于采用发酵液过滤、菌丝体超声破碎提取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析和结晶技术得到子囊霉素纯品。其具体步骤如下：

1)将链霉菌发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体；菌丝体采用超声波辅助提取3～5次，控制体系pH值，收集提取液，与滤液合并，得合并液；

2)将步骤1)中得到的合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有大孔树脂的床层进行吸附；并用4～5倍大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行冲洗，1～3倍的大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行解吸，控制柱床温度，收集解吸液；

3)将步骤2)收集的解吸液真空浓缩，旋干，得油状物；

4)将步骤3)中得到的油状物用有机溶剂溶解，油状物质量与有机溶剂体积比1∶20～1∶30g/ml，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用4～6倍硅胶体积的洗脱剂洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；

5)将步骤4)收集的含子囊霉素的活性组分经真空浓缩旋干，并用其质量体积比为1∶10～1∶20g/ml的有机溶剂溶解，将温度降低到0～10℃，保温使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；

6)将步骤5)得到的子囊霉素晶体用有机溶剂搅拌溶解后，加入该溶解液5～10倍体积的结晶溶剂静置，结晶得到子囊霉素。