[发明专利]利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法。

背景技术

丁二酸（succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组E.coli。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E.coli 由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。

E.coli野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以减少副产物的生成。但是，由于敲除了PFL基因，导致菌株不能生产乙酸，从而使伴随乙酸生成的ATP减少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长，并且生产丁二酸。

玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此大肠杆菌NZN111不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比1∶5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250～380μm，H₂SO₄用量3% (体积分数)，水解温度126℃，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) ₂中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。

稻草秸秆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121℃处理稻草秸秆1 h，再用20 g/L的NaOH于121℃处理秸秆1 h，葡萄糖和木糖二者总质量浓度都达50 g/L左右。

甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。

在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达E. coli ppc和pck，研究发现过量表达ppc可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3.5倍，而过量表达pck对发酵结果没有影响，但在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量。

发明内容

本发明的技术目的在于提供了一种基于ATP生物合成系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低了生产成本，提高经济效益。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。