[发明专利]一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸的测定方法，特别涉及一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法。

背景技术

  透明质酸是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位重复连接而成一种直链高分子黏多糖。透明质酸片段一般为大分子透明质酸钠降解而成，其降解方法可分为三大类：物理降解（例如加热、微波、超声波，射线等）、化学降解（例如酸、碱、氧化等）和生物降解（例如玻璃酸酶）。使用动物组织提取的玻璃酸酶降解透明质酸，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。但是在物理降解和化学降解过程中，透明质酸除了糖苷键的断裂，葡萄糖醛酸残基或乙酰氨基葡萄糖残基的结构也会发生变化。例如透明质酸在加热过程中产生双键，在碱降解过程中会发生脱乙酰基反应等。然而，透明质酸降解产生的透明质酸片段，是长短不一的透明质酸小分子片段的混合物，使用一般技术很难检测其结构的变化及变化程度。核磁共振技术（NMR）可用来测定物质结构，但这一技术对样品纯度要求很高，且仪器昂贵，检测费用很高，无法普及使用。

发明内容

 本发明的目的是提供一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法，可以对不同降解方法制备的透明质酸片段的结构变化进行定量分析。

本发明是通过以下措施来实现的：

本发明涉及一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将透明质酸片段用透明质酸酶酶解，然后采用高效液相色谱法测定透明质酸片段的含量；

2）将透明质酸片段采用咔唑法测定透明质酸片段的含量；

3）将步骤2）的测定值减去步骤1）的测定值，即为透明质酸片段结构变化的量。

上述本发明的定量检测透明质酸片段结构变化的的方法，优选的，所述的步骤1）包括以下步骤： 

a）样品预处理

精密称取透明质酸对照品和透明质酸片段样品适量分别置于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲液溶解并定容，加入透明质酸酶，37℃水浴2h；

b）色谱条件 

在本发明的高效液相色谱测定中，采用糖分析柱；流动相为0.5-1.0 mol/L的磷酸盐缓冲液；流速为0.3-1.0 ml/min；柱温为30±5℃；检测波长235±5nm；进样量为20μl；

c）结果计算

采用高效液相色谱分别对对照品酶解液和样品酶解液进行色谱分离，按外标法以峰面积计算样品含量。

 

本发明使用的透明质酸酶也称为玻璃酸酶，其降解透明质酸时，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。

本发明使用透明质酸酶对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高，而咔唑法的原理是只要样品中存在己糖醛酸结构即可与咔唑试剂发生显色反应，从而推算得到样品含量，特异性较差。这两种方法在测定大分子透明质酸钠和酶法生产的透明质酸片段含量时结果是一致的，但是在测定物理或化学方法制备的透明质酸片段的含量时，高效液相色谱法的测定值明显低于咔唑法的测定值。这是因为对于物理或化学方法制备的透明质酸片段，结构变化导致样品不能被完全酶解或发生结构变化的酶解产物不能在原保留时间被检测到；而咔唑法因为特异性差，测定结果不被样品的结构变化干扰。因此两种方法的差值可用于评估样品结构变化的程度。

 本发明中高效液相色谱法测定透明质酸片段含量特异性高，而咔唑法特异性差，利用两者的测定差值可评估不同方法制备的透明质酸片段结构变化的程度，对透明质酸片段的生产和应用有一定的指导作用。

具体实施方式

实施例1：

1.1样品：动物组织提取的玻璃酸酶降解产生的透明质酸片段，平均分子量为5800。

1.2方法：

a）样品预处理

精密称取透明质酸对照品和透明质酸片段样品适量分别置于50ml容量瓶中，用醋酸钠缓冲液溶解并定容，加入透明质酸酶，37℃水浴2h；

b）色谱条件 

高效液相色谱法的色谱条件为氨基柱（4.6mm×250mm），流动相为0.5 mol/L的磷酸钠缓冲液；流速为0.5ml/min；柱温为30℃；检测波长232nm；进样量为20μL。咔唑法参照欧洲药典中透明质酸钠的含量测定方法。

c）结果计算

采用高效液相色谱分别对对照品酶解液和样品酶解液进行色谱分离，按外标法以峰面积计算样品含量。

（以上的处理方法，实施例2-5与上基本相同）