[发明专利]肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法

权利要求书

1.一种肠出血性大肠杆菌主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，在设置阳性和阴性对照的情况下，从分子水平对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157进行核酸筛查；所述特异性引物为：

  引物  类别  序列组成  F3  前外引物  5’-CACACTTATTGGATGGTCTCA-3’  B3  后外引物  5’-TAGGCTGGGGAAACTAGG-3’  FIP  前内引物  5’-GGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGTTTTCTAACTAGGACCGCAGAGG-3’  BIP  后内引物  5’-CTGTCCACACGATGCCAATGTTTTTAATTAATTCCACGCCAACC-3’  LoopF  环状引物  5’-CAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCT-3’  LoopB  环状引物  5’-GCACCCTATAGCTGAGGATCT-3’

2.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，利用环介导等温扩增技术扩增肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157的特定靶核酸序列区域。

3.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控菌株购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，ATTCC编号700728，阳性对照质控品为利用天根基因提取试剂盒提取的大肠杆菌O157的基因，阴性对照质控品为不相同于扩增细菌靶基因的DNA，并使用电泳分析、沉淀分析或SYBR Green I荧光染料显色法同时检测阴阳对照和肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157靶基因扩增产物。

4.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，针对肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157中的genbank登录号为S83460的rfbE基因设计环介导等温扩增特异性引物。

5.根据权利要求1所述肠出血性大肠杆菌的主要血清型O157核酸筛查方法，其特征在于，所用的环介导等温扩增反应体系是：2x U-LAMP Mix 10ul，其组成成分：40mM Tris-HCl、pH8.8、20mM KCl、20m M(NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4mM dNTP、1.6M甜菜碱；所述引物混合物2ul，其终浓度组成为：F3为0.2umol/L，B3为0.2umol/L，FIP为1.6umol/L，BIP为1.6umol/L，LF为0.8umol/L，LB为0.8umol/L；模板DNA 1ul、BSt聚合酶1.5ul、补超纯水至20ul；反应程序：63℃30分钟→80℃3分钟→10℃保存。