[发明专利]一种表达Nectin-1基因胞外区片段的PK-15细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种包含α疱疹病毒的受体蛋白Nectin-1胞外区基因的重组质粒pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的构建，以及表达Nectin-1基因胞外区可溶性片段的猪肾传代细胞PK-15细胞系PK15-nectin-1-ecto的构建。 

背景技术

伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)又称猪疱疹病毒1型、传染性延髓麻痹病毒、奥叶兹基氏病病毒、奇痒症病毒。是引起猪、牛、羊、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。伪狂犬病毒是一种猪疱疹病毒，属于α-疱疹病毒亚科，病毒粒子直径约为110-150nm，具有典型的疱疹病毒的病毒粒子结构，衣壳壳粒的长度约12nm，宽9nm，位于胞浆内带囊膜的成熟PRV病毒粒子的直径约150-180nm，其空心部分的直径约4nm。 

伪狂犬病在世界范围内皆有爆发的案例，并对这些国家产生过巨大的经济损失。在二十世纪六十年代PRV在美国大面积爆发。这次爆发的时间与猪类产品生产的高强度和猪棚中高密度的养殖有惊人的一致性。在猪身上增收的赋税更加促进了PRV的传播。2003年，记录在案的PRV爆发的国家包括(按字母顺序排列)：白俄罗斯、巴西、古巴、法国、匈牙利、意大利、墨西哥、巴拿马、波兰、葡萄牙、罗马利亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文利亚、台湾和乌克兰。由于墨西哥与美国接壤，墨西哥爆发的PRV对美国造成了较大影响。 

PRV的起始复制发生在鼻内和口腔黏膜。PRV趋向于感染猪的呼吸和神经系统组织，病毒颗粒进入感官神经末端刺激对黏膜上皮细胞的感染。PRV感染的发病率和致死率随着猪年龄、动物的整体健康状态、病毒株和感染剂量的不同而变化。PRV感染的小猪反应最严重，表现出典型的中枢神经感染症状，未断奶仔猪的伪狂犬病致死率非常高，接近100％；而成年猪则表现出呼吸系统症状，发病的动物将变得瘦弱，体重急剧下降，给养殖业带来经济损失；如果感染发生在怀孕母猪妊娠的第一和第二个月，感染通常造成流产、死婴或出生后48小时就会死亡的弱胎。 

目前世界各地包括我国在内，广泛使用带有gE基因缺失的表型特征疫苗来控制和预防此病。而疫苗本身就可能会使动物产生潜伏感染。若要是能够从动物自身的角度出发，培育出具有抗伪狂犬病的转基因动物，无疑对养殖业来说，是划时代的进步。 

Nectin-1基因是α疱疹病毒的受体，介导伪狂犬病毒进入猪的上皮细胞和神经细胞。gD糖蛋白是PRV病毒吸附和入侵靶细胞过程中重要的蛋白质，它与病毒穿透，进入宿主细胞有 关。Nectin-1的N端有一个类似免疫球蛋白的结构域，该结构域与伪狂犬病毒糖蛋白基因gD结合，进而导致病毒囊膜与细胞膜融合，核衣壳进入细胞，造成机体感染发病。转基因动物表达Nectin-1基因胞外区可溶性的片段，在伪狂犬病毒感染细胞前先与gD基因竞争性结合，阻断gD基因与细胞上的Nectin-1基因受体相结合，达到阻止伪狂犬病毒感染细胞的目的，从而增强转基因动物抗伪狂犬病的能力。日本科学家Ono E在2004年利用α疱疹病毒的受体蛋白Nectin-1基因，运用转基因技术成功获得了能够表达Nectin-1基因的转基因小鼠，该小鼠在后期的试验中显示具有良好的抗α疱疹病毒的能力。 

目前常用的动物转基因技术有原核显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、体细胞核移植法、精原干细胞介导的基因转移法。这几种方法的差异见表1。 

表1常用的5种转基因技术的比较 

慢病毒(Lentivirus，LV)是逆转录病毒科中的一个属，慢病毒分为如下五类：灵长类慢病毒(如HIV-1和HIV-2)，非灵长类慢病毒、牛免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒等。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env 3个基本基因结构外，还包含4个辅助基因：vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。