[发明专利]一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用染色液和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种考马斯亮蓝的染色方法及其染色液和应用，具体涉及一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用染色液和应用。

背景技术

双向电泳和质谱(MS)是蛋白质组学研究的最重要的两项技术，经过SDS-PAGE之后，灵敏高效的蛋白染色成为后续蛋白质组学研究的先决条件(Choi et al.1996；Wang et al.2007a；Yasumitsuet al.2010b)。在蛋白分析和检测上，考染、银染和荧光染色是广泛使用在蛋白分析和检测上的三种染色方法(Patton，2000)。在这些方法中，银染是目前公认的除了放射性标记以外的最为灵敏的蛋白检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白(Yan et al.2000；Candiano et al.2004；Yasumitsu et al.2010b)。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白进行修饰，导致银染的质谱兼容性能普遍不佳(Candiano et al.2004；Lin et al.2008)。最近发展以来的荧光染料技术有很高的灵敏性和质谱兼容性(Patton，2000；Steinberg et al.2000；Candianoet al.2004)，但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件(Patton 2000；Steinberg et al.2000；Wang et al.2007a；Yasumitsu et al.2010a)，限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。

因此，在蛋白质组学研究中，考马斯亮蓝染色法(CBB)仍然目前仍然最受欢迎。该法具有良好的重复性、很低的染色背景、良好的灵敏度以及优良的质谱兼容性(Candiano et al.2004；Wang etal.2007a)。传统的CBB染料包括G-250和R-250，通常只能检测到微克或几百纳克水平的蛋白(Choiet al.1996；Yasumitsu et al.2010b)。为了提高染色效率，人们最近报道了许多更加灵敏的CBB改进染色方法(Choi et al.1996；Patton 2000；Pink et al.2010；Yang et al.2010；Yasumitsu et al.2010a；Yasumitsu et al.2010b)。几年前，本申请发明人通过改进固定液和敏化液的配方，以及增加R-250浓度，也发明了一种改进的CBB R-250染色方法，能检测到10纳克的BSA条带，有较高的分辨率和很好的MS兼容性(Wang et al.2007a；Wang et al.2009；Wang et al.2010；Wang et al.2011)。但是，这种染色方法步骤繁琐，耗时较长，限制了其应用范围。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种考马斯亮蓝G250染色液，该染色液集固定液，敏化液和染色液为一体，其使用CBB G-250做染料，这种染料能彻底的在染色液里溶解，并且染出胶的背景比较轻；其采用磷酸代替了醋酸，提高了染色的灵敏度。

本发明的第二个目的在于提供一种利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，该方法除具有较好的重复性、很低的染色背景外，该检测方法快速灵敏，检测到的蛋白点数目比较多；有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；应用范围比较广泛，能广泛的用在哺乳动物和植物组织中。

本发明的最后一个目的在于提供上述利用考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术手段来实现的：一种考马斯亮蓝G250染色液，含有以下组分：质量体积浓度为0.1-0.2％的CBB G-250，质量体积浓度为5-15％的硫酸铵，体积百分含量为3-8％的磷酸，体积百分含量为20-40％的乙醇，体积百分含量为5-20％的甲醇。

优选的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.12-0.13％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为8-12％，所述的磷酸的体积百分含量为4-6％，所述的乙醇的体积百分含量为20-30％，所述的甲醇的体积百分含量为10-15％。

最佳的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.125％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为10％，所述的磷酸的体积百分含量为5％，所述的乙醇的体积百分含量为30％，所述的甲醇的体积百分含量为10％。