[发明专利]一种发酵生产利普司他汀的方法及其培养基组份

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体为一种发酵生产利普司他汀的方法及其培养基组份。

背景技术

本发明涉及的发酵法生产的利普司他汀是新型减肥药奥利司他的中间体。奥利司他目前是全球唯一的减肥类药品，是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。

奥利司他的生产有两种方法，发酵合成法以及全合成法。全合成法生产成本比较高。发酵合成法生产成本比较低，更适合大规模生产。

美国专利US4598089、US2005089978A1涉及到的利普司他汀发酵工艺不采用流加补料以及中间补料的方法，发酵水平比较低。

欧洲专利EP0S03576A2以及国际专利WO2007134836A1、WO 2007078263A2涉及到的发酵工艺部分采用流加亚油酸和氨基酸的工艺，但是发酵水平比较低；欧洲专利EP0803576发酵水平低于1g/L。

国际专利WO2004003212采用了不同的淀粉底物，发酵水平为1.486g/L；国际专利WO03048335发酵水平为1.8g/L。

发明内容

为解决现有技术中发酵水平低、不稳定的问题，本发明提供了一种新的发酵生产利普司他汀的培养基和发酵工艺控制方法和发酵培养基组成成分。

本发明的方法包括毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)或其衍生物的斜面菌种培养、摇瓶种子液培养、种子液培养和发酵培养。所述毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)可以是ACCC 41038。具体工艺过程如下：

a.斜面菌种的制备：将冻干的菌种用无菌水稀释后涂布装有固体培养基的斜面上，温度28℃，湿度40～60％，培养8～10天。产孢后加无菌水制成孢子悬浮液。

b.摇瓶种子液制备：将斜面孢子接种摇瓶种子培养基，250rpm，温度28℃，培养20～30小时。

c.种子液的制备：将步骤b中培养好的摇瓶种子接种到储有种子培养基的种子罐中，接种量为种子培养基体积的0.1～0.8％(V/V)，在28℃下通气量0.8VVM～1.0VVM，单位VVM是体积/体积/分钟，罐压0.04～0.07MPa的条件下，培养20～40小时。

d.发酵培养：将步骤c中培养好的菌种接种到储有发酵培养基的发酵罐中，接种种子液的量占发酵培养基和种子液体积的5～10％(V/V)，在温度为28℃，通气量0.6VVM～1.1VVM，罐压0.06～0.08MPa，发酵过程中pH控制在6.5～7.5范围内，发酵过程中补入营养物质，培养160～190小时。

步骤a中所用培养基成分和含量为：葡萄糖2～8g/L，麦芽提取物2～8g/L，酵母提取物4～10g/L，琼脂10～20g/L，pH为6.9～7.4；步骤b中所用培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0～6.5；步骤c中所用液体培养基成分和含量为：甘油10g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物5g/L，脱脂豆粉20g/L，pH为6.0～6.5。步骤d中所用液体培养基成分和含量为：甘油10～20g/L，脱脂豆粉20～40g/L，豆油10～20g/L，消泡剂2～5g/L，发酵初始pH为6.7～7.0。

在步骤d发酵过程中，在接种后至30小时左右，即发酵培养基中的甘油消耗殆尽后，开始流加补料亚油酸和亮氨酸溶液(亮氨酸溶液浓度70g/L，pH为11)，补料流加速度为0.2～0.5g/L/h，单位g/L/h是克/升/小时，在发酵接种后至115h，补料速度进行调整，补料流加速度为0.2～0.5g/L/h。同时，在发酵过程中，在接种后至70小时左右，一次性补入灭菌的酵母提取物以及甘油，使培养基中酵母提取物以及甘油基质浓度在5～10g/L的水平。

本发明发酵罐发酵培养基中使用脱脂豆粉为主要氮源，甘油和豆油为主要碳源，发酵培养基中无须添加无机盐。在发酵表达利普司他汀阶段连续补料亚油酸和氨基酸的基础上，在发酵的特定阶段一次性补加一定量的甘油和酵母提取物，避免了现有技术中的高粘度、溶氧不好控制的情况，提高了发酵过程中表达的稳定性，提高了发酵效价，降低了发酵成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不仅限于以下实施例。