[发明专利]一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法

权利要求书

1.一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，其特征在于：用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒；

1）检测方法的构建：

包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.01-0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有 0.05%₀叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%₀叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；

多克隆抗体的制备：将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均匀，对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；第二次免疫，将1.0mg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1：3000为止；

竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/ml，每孔加50μl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50μl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤3-5次；

加酶标二抗：将0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体以１：5000稀释后加入，每孔加入100μl，37℃，30min后，用PBST洗涤3-5次；

显色：每孔加入显色液100μl，37℃显色15min；最后每孔加入终止液２M硫酸溶液50μＬ；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的乳酸链球菌素的含量；

上述乳酸链球菌素标准品购置于 sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体购置于 Jackson ImmnoResearch LABORATORIES,INC；

2）对检测样品的处置：

乳饮料：将0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L磷酸盐缓冲液，即为复溶工作液，对样品处置，即稀释10倍；

肉制品：将样品制成粉末状，取1g样品置于50ml离心管里，加入5ml的复溶工作液，充分震荡混匀，后静置10min，提取上清1-2ml，用于分析。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：该方法的检测试剂盒包括：

1）包被原的酶标板1块，其包被原为乳酸链球菌素与载体蛋白偶联物；

2）酶标二抗工作液1瓶，其工作液用0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的酶标二抗获取，7ml/瓶；

3）抗体工作液1瓶，其工作液用2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液稀释1000倍的抗体获取，8ml/瓶；

4）乳酸链球菌素标准品溶液，共6瓶，浓度分别为0mg /L，0.1mg/L，0.5mg/L，2.5mg/L，12.5mg/L，62.5mg/L；

5）底物显色液2瓶，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶；

6）终止液1瓶，含1-2mol/L硫酸，7ml/瓶；

7）浓缩洗涤液1瓶，含0.05%吐温、0.1% 明胶、0.05%叠氮钠的磷酸盐缓冲液0.02M、pH 7.4，40ml/瓶；

8）复溶工作液1瓶， 50ml/瓶。