[发明专利]一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，获取的食品天然防腐剂—乳酸链球菌素酶联免疫检测方法，尤其适用于乳制品及饮料与肉制品中的乳酸链球菌素含量的测定。 

背景技术

乳酸链球菌素（Nisin）是从乳酸乳球菌或乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质，是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。我国于1990年开始批准使用Nisin，到目前为止，全世界约有50多个国家和地区广泛使用Nisin。 

Nisin是由34个氨基酸组成的多肽，其分子量为3510，属于羊毛硫抗生素（Lantibiotics）,活性部位含有大量的稀有氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、β-甲基脱氢丙氨酸等一些非编码的氨基酸。Nisin的活性分子常以二聚体和四聚体的形式存在，其分子量为7000和14000。 

乳酸链球菌素能有效杀死或抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，特别是细菌孢子：如葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、小球菌、明串珠菌、芽孢杆菌等，对乳酸链球菌素很敏感。 

乳酸链球菌素定量分析的最初测定的方法为1934年Cox GA等人建议采用的甲基蓝还原法，后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析方法，包括试管稀释法、浊度分析法、琼脂扩散法、ATP生物发光测定法、绿光荧光蛋白测定法和微量滴定法等。1990年Falahee发展了多克隆抗血清分析乳酸链球菌素的酶联免疫分析法。1996年Suacrez,Rodriguez设计了多克隆抗体酶联免疫吸附法。Bouksaim报道多克隆抗体的酶联免疫分析法。 

目前，我国关于乳酸链球菌素的测定有两种方法，其一是琼脂扩散法，该方法是依据企业标准QB 2394-2007《 食品添加剂 乳酸链球菌素》，采用琼脂扩散法的原理在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果，由抑菌圈直径及标准效价换算出效价，确定其含量，由于该方法具有灵敏度低、无法精确定量、易受干扰因素的影响、易于污染环境等缺点，不易于各检测机构推广使用。其二是液相色谱法，经查2010年建立了液相色谱检测方法并申请了专利，该方法由于所需仪器及耗材均较昂贵，检出限低，且耗时长，不易大范围推广。本次文献检索披露的内容有《天然防腐剂—乳酸链球菌素》）（中国食品与营养，2008年第4期）和《乳酸链球菌素检测技术的研究进展》(中国食品添加剂，2008年第5期)。 

本发明所建立的食品中乳酸链球菌素酶联免疫快速检测方法，既定性也能够定量，是目前国际公认的用于测定食品中添加剂含量的方法，具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、快速简便、无污染、重现性好等特点，适宜普遍推广和应用。 

发明内容

本发明的目的在于：提供乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法及试剂盒为食品安全保驾护航，所建立的简单、敏感、直接的免疫学方法有重要的实践意义。 

本发明目的是这样实现的：一种食品防腐剂-乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法，用乳酸链球菌素作为抗原进行动物免疫得到多克隆抗体，以乳酸链球菌素半抗原与卵清蛋白ＯＶＡ的偶联物作为包被抗原，以乳酸链球菌素为标准品，构建免疫检测及对样品的处置方法，即获取该方法的载体试剂盒； 

1）检测方法的构建：

包被抗原的制备：用pH值为9.6 的0.01-0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释包被抗原1000倍，加入酶标板，每孔100μl，37℃孵育2h，倾去包被液，用含有0.05%₀叠氮化钠、0.1%明胶和0.05%吐温的磷酸盐缓冲液，即0.02M、pH 7.4，洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，即0.1%₀叠氮化钠和10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；

多克隆抗体的制备：将1.0mg/ml的乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏佐剂混合均匀，对首次免疫的兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；第二次免疫，将1.0mg/ml乳酸链球菌素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀，对兔子实施颈背部皮下多点注射，每点0.2ml；每次注射间隔2周，采血检测抗血清效价，直到抗体效价大于1：3000为止；

竞争反应：用0.1%牛血清白蛋白的0.03-0.06mol/L的磷酸盐缓冲液，对乳酸链球菌素的标准品实施梯度稀释，其梯度为0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μg/ml，每孔加50μl；将制备的多克隆抗体以2.5%酪蛋白的磷酸盐缓冲液按1：1000比例稀释后加入，每孔加入50μl，37℃温育30min，然后用PBST洗涤3-5次；