[发明专利]检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明所涉及的一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用，属于病毒核酸检测领域，适用于临床及科研中对于牛病毒性腹泻病毒感染的快速定量检测，还涉及应用于疫苗生产用牛血清及牛睾丸细胞源猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中BVDV污染的检测。

背景技术

牛病毒性腹泻是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种在世界范围内广泛传播的牛羊传染病。BVDV是危害养牛业、养羊业和养猪业的重要病原之一，能引起感染动物产生一系列复杂的临床症状，包括病毒性腹泻、粘膜病、持续感染与免疫耐受、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征等[沈敏，王新华，钟友刚.牛病毒性腹泻病毒致病机理研究进展.动物医学进展，2002，23(6)：1-4]。欧洲国家在20世纪60年代牛肉和奶牛中BVDV的阳性率就已经达到了53％-73％，90年代以来要找到BVDV阴性的牛已是难事了。而近年来，我国各地几乎都有该病的报道，并且患病动物包括猪、牛、牦牛、羔羊、山羊和鹿等多种动物。目前，疫病的早期特异性诊断及疫苗接种等是有效预防控制牛病毒性腹泻的重要手段。同时随着生物制品研究及生产过程中对牛血清的使用量日益加大，牛血清中BVDV的检测也成为疫苗生产、质控过程中十分重要的一个环节。

检测BVDV的方法很多，常采用的检测方法主要包括血清学中和试验、细胞分离培养、酶联免疫吸附试验、PCR技术等。血清学方法多存在费时、费力、准确率低等缺点。我国诊断BVDV国家标准技术采用培养细胞分离病毒的方法，但该方法费时费力，加之病毒分离率低，有些非致细胞病变型BVDV在细胞培养中不出现细胞病变，因而不利于大规模应用检测。而分子生物学的常规方法虽然在某些方面可以弥补，但假阳性、环境污染、重复性不高等不足限制了推广应用。近年来逐渐发展起来的实时荧光定量PCR技术是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物和一个特异性的荧光探针或荧光染料，利用能够实时监测的荧光PCR仪来检测病原体靶核苷酸序列的技术。它不但克服了传统PCR技术的缺点，而且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，因而成为一种越来越重要的检测技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该PCR试剂盒不仅可适用于目前市场上所有类型的荧光定量PCR仪，更重要的是能够快速准确的对牛病毒性腹泻病毒进行定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种上述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，包括临床及科研中对于牛病毒性腹泻病毒感染的快速定量检测和对牛血清及猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹泻病毒进行监测。

基于上述目的，本发明采用的主要技术方案有：

1.引物探针设计

通过分析牛病毒性腹泻病毒各基因片段保守性，并结合荧光PCR引物探针设计特点，确定牛病毒性腹泻病毒的5’UTR序列片段作为本方法中荧光PCR引物探针设计的模板。

从GenBank数据库下载所有已知牛病毒性腹泻病毒的5’UTR序列，利用DNAStar软件进行同源性排序分析比较，选出在牛病毒性腹泻病毒5’UTR序列中种内保守种间特异的核苷酸片段，然后利用Primer Express及DNAStar软件设计多对检测牛病毒性腹泻病毒的引物和探针，进一步实验筛选出最佳引物和探针组合，确定为本方法中所使用的引物和探针。其中引物探针序列如下：

上游引物PF：5’-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3’(SEQ ID NO：1)

下游引物PR：5’-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3’(SEQ ID NO：2)

荧光探针PB：5’FAM-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-BHQ 13’(SEQ ID NO：3)

2.病毒RNA的提取

2.1组织样品RNA的提取：取待检样本50～100mg于无菌1.5ml离心管中，按1∶5比例加入PBS液，匀浆仪充分匀浆，4000rpm离心10min，取上清液200μL于新的无菌1.5mL离心管中，编号备用。