[发明专利]一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种骆驼蓬脂转移蛋白PHP，其特征在于：N端含有SEQID NO：1所示的氨基酸序列ITCPQVTQSLAPCVPYLISG。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征是：所述蛋白来源于药用植物骆驼蓬(Peganum harmala L.)。

3.根据权利要求1所述的蛋白，其特征是：天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，分子量为16kDa，单一亚基的分子量约为8kDa，是一种等电点pI为8.4的碱性蛋白质。

4.制备如权利要求1～3任一一项所述蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)粗品制备：以骆驼蓬种子为材料，将其粉碎后，加入pH为7.0-7.5的中性至弱碱性条件的PBS磷酸缓冲液，低温搅拌抽提下过夜，低温离心后收集上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为30％-50％之间，低温静置4h，离心收集上清液，弃沉淀；继续在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为60％-80％之间，再次低温静置4h后，离心收集沉淀，并溶于少量磷酸缓冲液中，透析除盐，冷冻干燥得蛋白粗品；

(2)阳离子交换层析分离纯化：采用Resource S或与其性质相当的阳离子交换柱，对上述步骤(1)得到的粗品蛋白进行层析，上样后用适当浓度为0.02-0.05mol/L的PBS磷酸缓冲液先洗去未结合的蛋白，再用含0.1-1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，用磷酸盐缓冲液充分透析后保存备用；

(3)分子筛纯化：将上述步骤(2)得到的样品上Superdex 75型分子筛柱，用含有一定浓度NaCl的浓度为0.02-0.05mol/L的PBS磷酸缓冲液洗脱，分步收集，检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP纯品；

(4)上述步骤(3)得到的纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP是一种新的脂转移蛋白，该蛋白具有抗真菌、抑制肿瘤活性及抑制HIV-1反转录酶活性的作用，在食品果蔬防腐剂、农业上抗真菌生物农药领域及在肿瘤和抗病毒的蛋白药物治疗方面具有良好的应用前景。

5.权利要求1～4任一一项所述蛋白，其特征是：所述蛋白具有抑制真菌生长的活性，在制备食品果蔬防腐剂及抗农业病原真菌的生物农药中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：所述真菌为交格链孢菌(Alternaria alternata)、指状青霉菌(Penicillium degitatum)、根霉病菌(Rhizopus stuolonifer)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和意大利青霉菌(Penicillium italicum)等5种植物病原真菌。

7.权利要求1～4任一一项所述蛋白，其特征是：所述蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，在制备治疗肿瘤药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征是：所述的肿瘤为宫颈癌、胃癌、食管癌和黑色素瘤。

9.权利要求1～4任一一项所述蛋白，其特征是：所述蛋白具有抑制HIV-1反转录酶活性的作用，在制备抗HIV病毒的蛋白药物来治疗HIV疾病的药物中的用途。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于优化的骆驼蓬脂转移蛋白的制备条件为：

(1)优化的粗品制备条件为：以骆驼蓬种子为材料，将其粉碎后，加0.02mol/L，pH 7.2的PBS磷酸缓冲液，4℃过夜搅拌抽提，低温离心后收集上清液，在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为50％，在4℃静置4h，离心收集上清液，弃沉淀；继续在上清液中缓慢加入硫酸铵调至饱和度为70％，在4℃静置4h后，离心收集沉淀，并溶于少量磷酸缓冲液中，透析除盐，冷冻干燥得蛋白粗品。

(2)优化的阳离子交换层析分离纯化条件为：采用Resource S阳离子交换柱，将上述步骤(1)中所得到的蛋白粗品进行层析，上样后用0.02mol/L，pH 7.2的PBS磷酸缓冲液先洗去未结合的蛋白，再用含0.1-1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，用磷酸盐缓冲液充分透析后保存备用。

(3)优化的分子筛纯化条件为：分子筛为Superdex 75型柱，将上述步骤(2)中得到的经离子交换处理后的样品上分子筛柱，用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L，pH 7.2的PBS磷酸缓冲液洗脱，分步收集，检测活性后收集具有抗菌和抗肿瘤活性的组分，透析除盐，冷冻干燥即得到纯化的骆驼蓬脂转移蛋白PHP纯品。