[发明专利]一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种从骆驼蓬种子中分离纯化出的分子量为16kDa的脂转移蛋白PHP，更具体地，本发明涉及一种具有抗真菌、抑制肿瘤活性及抑制HIV-1反转录酶活性的骆驼蓬脂转移蛋白，以及利用骆驼蓬种子为原料进行粗品制备、阳离子交换层析分离和分子筛纯化制备所述蛋白质的方法，和所述蛋白质的应用。

背景技术：

植物生长常会受到各种真菌的侵袭，在长期进化过程中，植物体形成了一套天然防御体系来与外源侵袭物对抗。植物抗真菌蛋白(antifungal protein，AFP)就是其中的一类，它们可抑制真菌生长或杀死真菌。根据植物抗真菌蛋白的作用机制、结构和序列特性，可将其大体分为以下几类：病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)、防御素(defensins)、类亲环素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖体失活蛋白(ribosome inactivating Protein，RIPs)、脂转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)、2S清蛋白类(2S albumin proteins)及其他蛋白。脂转移蛋白(lipid transfer protein，LTP)是一类分子量相对较小的碱性蛋白质，由于能够转移磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸，并能够促进线粒体和微体之间的磷脂交换而得名(Gincel.E，etal.1994)，在动物、植物、酵母、真菌和一些细菌中均有发现。在植物中至今只发现有非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，其脂转移活性具有广泛性和不确定性。现在已从多种植物中分离得到nsLTPs，如玉米、水稻、大麦、谷子、洋葱、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、箩卜、桃、拟南芥等许多不同植物组织中发现。并已对来自水稻、玉米、桃等植物中的nsLTPs的分子结构进行了解析。在植物中非特异脂转移蛋白均为可溶性蛋白，含量丰富，可以达到可溶蛋白总量的4％。据报道，植物的许多器官都有LTP的分布，如种子、茎、叶、根、十字花科的果实以及花器官，而且发现在围绕植物器官的表皮细胞和外周细胞、细胞壁和表皮组织角质层中的含量特别高(Trends Microbiol，etal.1995)。最初对植物非特性脂转移蛋白的研究主要集中在生物膜之间脂类物质的转运。随着不断的深入研究，发现nsLTP蛋白在植物抗病虫害、抗肿瘤及抗病毒等方面也具有非常重要的作用。近年来，从传统中草药中继续挖掘新的活性蛋白质成分，以期找到一些在农业和医药上具有应用价值的蛋白质或多肽，已经成为科研工作者的一个重要的研究方向。

骆驼蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)多年生草本植物。多生于干旱草地、盐碱化荒漠地带。分布于内蒙古、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省区；蒙古、苏联也有分布。作为维吾尔传统药材已有很久的使用历史，其种子或全草可用于治疗咳嗽气喘、风湿痹痛和无名肿痛等病症。骆驼蓬中生物碱等化学成分具有抗菌、杀虫和抗肿瘤等活性，但同时对机体有一些神经毒副作用。本发明首次从骆驼蓬种子中分离纯化出一种分子量为16kDa的脂转移蛋白PHP，具有抗真菌和抗肿瘤活性及抑制HIV-1反转录酶活性的作用，未见现有文献报道。本发明为科学认识骆驼蓬中活性蛋白的功能提供依据，在植物基因工程、农业抗真菌病原病制剂和抗癌蛋白药物的筛选方面具有重要的理论和应用价值。

发明内容：

本发明提供一种骆驼蓬脂转移蛋白PHP，其N端含有SEQID NO：1所示的氨基酸序列ITCPQVTQSLAPCVPYLISG，通过N端氨基酸残基的同源性比较，说明是一种新的脂转移蛋白。所述蛋白来源于药用植物骆驼蓬(Peganum harmala L.)种子，是在天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，分子量为16kDa，单一亚基的分子量约为8kDa，该蛋白是一种等电点pI为8.4的碱性蛋白质。本发明首次进行了骆驼蓬脂转移蛋白的分离纯化，以骆驼蓬种子为原料，通过硫酸铵分级沉淀，阳离子交换层析及凝胶过滤分子筛层析，得到了一种骆驼蓬脂转移蛋白PHP。对该蛋白进行了抗真菌、抗肿瘤活性和抑制HIV-1反转录酶活性及应用分析。

一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用，包括以下步骤：