[发明专利]水-辛酸两步法提取卵黄免疫球蛋白工艺

说明书

一 技术领域 

   本发明涉及水-辛酸两步法提取免疫球蛋白工艺，一种用于卵黄中提取免疫球蛋白的一种工艺，属于生物技术制药中卵黄免疫球蛋白制备技术领域。

二 背景技术

鸡卵黄免疫球蛋白G抗体是一种7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白质分子量约为180kDa，含两个亚单位，即67～70kDa的重链和22～30kDa的轻链，又称IgY（Yolk Immunoglobulin），存在于免疫后母鸡的卵黄中。 

实验证明，受免疫刺激后，母鸡产生免疫反应，在输卵管内卵黄成熟期，血液中IgY可被选择性地转移到卵黄中，而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类。早在60年代，科学家们就发现鸡卵黄中存在IgY抗体，其含量与鸡血清相似甚至更高。卵黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。

由于如前所述卵黄作为特异抗体IgY的许多优点，IgY在免疫学检测方面正在受到愈来愈广泛的应用。在免疫治疗方面，因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳定，可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时，IgY成为首选。

卵黄是由约48.7%的水、16.6%蛋白质和32.6%的脂类及其它组分组成。由于很难将IgY抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代初，国外科研人员相继建立了脱脂方法，如Polson的聚乙二醇（PEG）提取法及其改良方法（1980和1985年），Jenseniusde 硫酸葡聚糖提取法(1981)，以及氯仿法和水稀释法等。 国内起步较晚，方法也主要是以上方法基础上进行改良。以上方法虽然能获得一定的IgY回收率，但是应用中存在一定缺陷。首先，这些方法中许多需要大量有毒试剂，脱脂后去除这些试剂不然增加成本；其次这些方法需要使用大型离心机等仪器，这将限制IgY的工业化生产；而且这些方法效率和纯度都不高，影响了IgY的质量。

近年来，我国科研工作者对IgY的提取也进行了很多研究。如山东农业大学柴家前的发明专利一种提取卵黄中抗体的新方法（申请号 95110458.6）中采用加权脱脂法。1998年山东农业大学常韦山的发明专利精制卵黄抗体的制备工艺（ZL专利号9811025.8）中公开了苯酚脱脂法。还有山东农科院何元龙的发明专利卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术（申请号 200810014515.1）。以上这些方法都有一些不足，有的试剂有毒，在IgY液中很难去除；有的IgY回收率低，纯度不高，影响抗体的使用质量。

三 发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种从卵黄中提取IgY的制备方法。在保证IgY抗体效价的同时，采用剂量少、安全、低毒的脱脂试剂，操作过程中方便，不用使用昂贵的仪器，降低生产成本，且IgY纯度较高。

技术方案

为了达到上述目的，本发明所用的技术方案是：将水和卵黄原液直接混合，通过机械搅拌，打破卵黄的乳化状态，使卵黄中油脂颗粒与蛋白质分离，然后通过静置，使卵黄油脂发生相互凝集而自然沉淀，获得的上清液与辛酸混合，辛酸与水溶液中的杂蛋白反应，形成不可逆的沉淀，唯IgY类抗体不与反应，留在水溶液中，从而达到提取IgY的目的。

本发明具体方法如下：

水-辛酸两步法法分离卵黄免疫球蛋白的工艺，其特征在于，第一步，将纯水与卵黄原液直接混合充分搅拌，然后静置，卵黄油脂相互凝集而自然沉淀，沉淀后的上清液为卵黄水溶性组分，即卵黄免疫球蛋白IgY与其它可溶性蛋白的混合物；第二步，将第一步获得的卵黄水溶性组分与辛酸或辛酸溶液混合，搅拌均匀后静置，辛酸和蛋白发生不可逆反应，形成沉淀，IgY不与辛酸反应，其水溶液即为IgY的水溶液。

所述第一步中，在2℃~30℃环境中，弃蛋清取卵黄，加入纯水稀释体积n倍，其中0<n≤10，充分搅拌均匀，静置沉淀，沉淀后取上清液，上清液为卵黄水溶性组分，即卵黄免疫球蛋白IgY与其它可溶性蛋白的混合物；。