[发明专利]一种产脂肪氧合酶的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产脂肪氧化酶(lipoxygenase, EC 1.13.11.12，简称LOX)的基因工程菌及其构建方法与应用，特别是一种高产脂肪氧化酶的基因工程菌及构建方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，简称LOX)属氧化还原酶，能专一催化含有cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯，使其通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化物。

脂肪氧合酶又称不饱和脂肪酸氧化还原酶，存在于苜蓿、豌豆、扁豆、等豆科植物中，萝卜及马铃薯中也有，但以大豆中的活性最强。由大豆结晶的脂肪氧合酶，相对分子量为102000，等电点为5.14。最适pH不能简单决定，而是受底物的溶解性左右，一般pH 6.10-3.10，最适温度在20-30℃之间。脂肪氧合酶可催化分子氧对面粉中具有戊二烯-1, 4双键的油脂发生氧化，形成氢过氧化物。氢过氧化物氧化蛋白质分子的巯基(-SH)形成二硫键(-S-S-)并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变得更大，从而起到强筋的作用。脂肪氧合酶可通过耦合反应破坏胡萝卜的双键结构，从而起到漂白面粉，改善面粉色泽的作用。而脂肪氧合酶催化亚油酸生成的过氧化物，可改善面包的香气，为面包增香。由此可见，脂肪氧合酶兼具强筋和增白的功效，可以用来替代强筋剂溴酸钾以及减少漂白剂过氧化苯甲酰的用量。

目前，国内外对脂肪氧合酶研究报道很少，主要集中于生理功能研究，关于高产脂肪氧合酶基因工程菌的报道则更少。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种产脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，简称LOX)的基因工程菌，该菌株所携带的质粒上含有脂肪氧合酶基因，可分泌表达脂肪氧合酶基因。

所述脂肪氧合酶基因来源于铜绿假单胞菌，该菌株于2011年5月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011185，地址：中国，武汉，武汉大学，其分类学命名为铜绿假单胞菌BBE(Pseudomonas aeruginosa BBE)。

因大肠杆菌表达体系具有发酵周期短、蛋白表达量高、提取工艺成熟等优点，优选大肠杆菌表达体系为宿主。

本发明要解决的技术问题之二是提供了一种脂肪氧合酶基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题提供如下技术方案：

第一步 脂肪氧合酶基因的获得

根据NCBI数据库中PA1169基因设计引物，以铜绿假单胞菌ATCC 15692为模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因；

第二步 脂肪氧合酶(LOX)重组质粒的构建

为了使脂肪氧合酶基因能在大肠杆菌中的可控高效表达，选用带有T7启动子的表达载体(例如pET22b，美国Invitrogen公司)，利用克隆得到的脂肪氧合酶基因序列端的3’Nde限制性内切酶位点与5’端的HindⅢ限制性内切酶位点，将脂肪氧合酶基因克隆入载体pET22b；由于在T7启动子后面有一段pelB信号肽序列，这也为脂肪氧合酶基因在大肠杆菌中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pET22b载体中含有氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便；

将含有脂肪氧合酶基因的载体与要连接的表达载体pET22b进行Nde和HindⅢ酶切，连接得到含有脂肪氧合酶基因的重组质粒pET22b-LOX；

第三步 脂肪氧合酶基因工程菌的构建

将重组质粒pET22b-LOX转化宿主大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3))，构建高效表达脂肪氧合酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌；

本步骤采用的含脂肪氧合酶的重组表达质粒pET22b-LOX可转化大肠杆菌(E.coli Rosetta(DE3)Invitrogen)，成为能分泌表达外源脂肪氧合酶的功能大肠杆菌；在外源诱导物IPTG存在的情况下，T7启动子启动外源脂肪氧合酶基因的表达，信号肽指导表达产物进入大肠杆菌的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。