[发明专利]不对称病毒纳米颗粒的制备方法

权利要求书

1.一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法为：

对病毒衣壳蛋白表面进行基因改造，使病毒衣壳蛋白同时带有耦合的功能基团和分离基团，然后将该改造后的病毒衣壳蛋白与野生型病毒衣壳蛋白充分混合，并控制该两种病毒衣壳蛋白的比例，同时根据病毒衣壳蛋白的总量加入相应无机纳米颗粒，实现病毒纳米颗粒的可控组装，获得不对称功能化的纳米颗粒，即目标产物。

2.根据权利要求1所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述病毒衣壳蛋白包括SV40衣壳蛋白VP1，所述功能基团包括半胱氨酸，所述分离基团包括His-tag。

3.根据权利要求1所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

ⅰ.在SV40衣壳蛋白的VP1 Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突变为Cys，并在第139位插入His-tag，构建载体His-mvp1，并在生物体中实现表达，经纯化，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1； 

ⅱ.取改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1与原野生型SV40衣壳蛋白wtvp1充分混合，通过调节该两种衣壳蛋白的比例，实现对组装体病毒纳米颗粒个体中该两种衣壳蛋白成分比例的控制，根据衣壳蛋白总量与无机纳米颗粒物质的量比60:1~180:1添加无机纳米颗粒，在低盐溶液中透析完成共组装；

ⅲ.用金属螯合亲和层析法分离纯化组装产物，除去同种病毒衣壳蛋白自组装的产物，获得单一的不对称病毒纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法还包括如下步骤：

ⅳ.用蔗糖连续密度梯度法对步骤ⅲ获得的不对称病毒纳米颗粒进行分离，获得大小均一的不对称结构。

5.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ具体为：

将His-mvp1表达质粒用氯化钙法转入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞，在 LB培养基中培养细菌并诱导表达重组蛋白His-mvp1，其后依次经离心、破碎和柱层析处理，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1；

所述LB培养基中还含有抗生素和诱导剂，所述抗生素包括氨苄青霉素和/或氯霉素，所述诱导剂包括IPTG。

6.根据权利要求5所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ包括如下步骤：

a、将His-mvp1表达质粒用氯化钙法转入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞，涂平板至少12 h后，挑取单克隆接入LB培养基中，加入抗生素，于37℃恒温振荡培养过夜，其后按照1%接种量转接于LB培养基中，加入抗生素，于37℃恒温振荡培养，并加入诱导剂，在25℃～37℃继续诱导培养，离心收集菌体；

b、 将收集到的菌体清洗后重悬于binding buffer中进行超声破碎，离心破碎后的菌液，取上清液进行柱层析，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1。

7.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ⅱ具体为：将摩尔比1:50~1：11的His-mvp1与wtvp1充分混合，并添加无机纳米颗粒，无机纳米颗粒与衣壳蛋白总分子数的比例控制为60：1~180:1，在低盐溶液中透析完成共组装。

8.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ⅲ中所获得的不对称病毒纳米颗粒具有正二十面体结构，其外壳是由1个His-mVP1五聚体和11个wtvp1五聚体组成，中心是无机纳米颗粒。

9.根据权利要求3所述的不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤ⅲ具体为：

采用镍亲和层析法，首先以15-30 mM咪唑溶液除去不带有改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1的组装产物，即无功能基团和分离基团的病毒纳米颗粒；然后取200~1000 mM咪唑溶液洗脱得到组装产物中只含有一个改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1单元的病毒纳米颗粒，即不对称病毒纳米颗粒。