[发明专利]不对称病毒纳米颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及在分子水平上用一种可控的方法操纵生物大分子的自组装，尤其涉及一种不对称病毒纳米颗粒（asymmetric VNPs）的制备方法，属于纳米生物技术领域。

背景技术

纳米技术，是指在0.1～100纳米的尺度里，研究电子、原子和分子运动规律和特性以及对物质和材料进行处理的技术被称为纳米技术。1981年科学家发明研究纳米的重要工具—扫描隧道显微镜，原子、分子世界从此可见。1990年首届国际纳米科技会议在美国巴尔的摩举办，纳米技术形式诞生。

纳米颗粒因其独特的光、电、磁和力学等性质，又因其具有尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子比例大等特点，在生物传感、材料科学、能源和信息技术等领域得到了广泛关注，是研究得最早和最为成熟的纳米材料，可用于发展具有特殊性质和功能的纳米器件。然而，由于表面化学各向同性，纳米颗粒作为构筑基元缺乏多样性和稳定性,因此在功能和应用上受到一定限制。故发展纳米材料和器件的关键问题之一转变成控制纳米构筑单元的组装。

近年来发展了一系列针对纳米颗粒的不对称修饰方法,为组装纳米颗粒的可控性提供了一些新颖而有效的策略。这些方法可以将本身各向同性的纳米颗粒修饰成各向异性,使得常见的功能性纳米颗粒成为所需的构筑单元。近年来,基于各向异性的组装由于其优异的可控性而受到广泛关注。对于形貌不对称的纳米材料,以及有性质显著不同的晶面的纳米晶,它们很容易依靠本身的各向异性进行修饰与组装。很多计算模拟结果表明,对纳米颗粒进行不对称修饰可以使其由各向同性变为各向异性, 进而能够进行更复杂、可控和定向的组装。但正是因为纳米颗粒本身形貌和表面性质具有球对称性,一般的方法只能形成均匀的修饰层。最近几年,陆续报道了一系列有效的对纳米颗粒不对称修饰的方法,使得此瓶颈得以突破,同时也为可控组装提供了更好的策略和发展空间。

蛋白质、DNA等生物大分子是天然的纳米材料，它们结构多样，可以自我复制，高度均质，易于人为操纵和大量制备。DNA在纳米技术发展中已表现出了独特优势；与DNA相比，蛋白质携带的结构信息更加丰富，因而有望为纳米技术提供更灵活的操作平台。其中，蛋白笼形结构，像病毒衣壳，铁蛋白，热击蛋白，已经被广泛用于研究大分子自组装的模型，以及材料合成的纳米反应器。但是，在分子水平上用一种可控的方法操纵他们的自组装，以及准确分析他们的组装产物，仍然是具有挑战性的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其可在分子水平上实现生物大分子的可控自组装，从而克服现有技术中的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种不对称病毒纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法为：

对病毒衣壳蛋白表面进行基因改造，使病毒衣壳蛋白同时带有耦合的功能基团和分离基团，然后将该改造后的病毒衣壳蛋白与野生型病毒衣壳蛋白充分混合，并控制该两种病毒衣壳蛋白的比例，同时根据病毒衣壳蛋白的总量加入相应无机纳米颗粒，实现病毒样纳米颗粒的可控组装，获得不对称功能化的纳米颗粒，即目标产物。

进一步的讲，所述病毒衣壳蛋白包括SV40衣壳蛋白VP1，所述功能基团包括半胱氨酸，所述分离基团包括His-tag。

该方法包括如下步骤：

ⅰ.在SV40衣壳蛋白的VP1 Loop中引入Cys，即，在第74位氨基酸突变为Cys，并在第139位插入His-tag，构建载体His-mvp1，并在生物体中实现表达，经纯化，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1； 

ⅱ.取改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1与原野生型SV40衣壳蛋白wtvp1充分混合，通过调节该两种衣壳蛋白的比例，实现对组装体病毒纳米颗粒个体中该两种衣壳蛋白成分比例的控制，根据衣壳蛋白总量与纳米颗粒物质的量比60:1~180:1添加无机纳米颗粒，在低盐溶液中透析完成共组装；

ⅲ.用金属螯合亲和层析法分离纯化组装产物，除去同种病毒衣壳蛋白自组装的产物，获得单一的不对称病毒纳米颗粒。

该方法还包括如下步骤：

ⅳ.用蔗糖连续密度梯度法对步骤ⅲ获得的不对称病毒纳米颗粒进行分离，获得大小均一的不对称结构。

步骤ⅰ具体为：

将His-mvp1表达质粒用氯化钙法转入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞，在 LB培养基中培养细菌并诱导表达重组蛋白His-mvp1，其后依次经离心、破碎和柱层析处理，获得改造后的病毒衣壳蛋白His-mvp1；