[发明专利]一种隐性混合池测序基因克隆方法

权利要求书

1.一种隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：亲本杂交构建分离群体；按每个个体目标性状的差异对分离群体分池，获得隐性池，通过对亲本的高通量测序获得显性与隐性亲本特异位点，与隐性混合池测序结果比较获得候选位点；通过PCR检测隐性池中每一基因型候选位点，或通过富集隐性池中候选位点后重测序的方式确定目标位点；PCR扩增克隆目标基因，并通过遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

2.根据权利要求1所述的隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状的亲本杂交后分离构建分离群体；

(2)隐性池的获得：随机选择分离群体中目标性状为隐性的个体组成隐性池；

(3)DNA提取：取两个亲本的组织，分别提取并获得两个亲本的基因组DNA；同时将隐性池中个体组织等量混合后再提取DNA，获得隐性池DNA；

(4)确定候选位点：按高通量测序流程分别构建亲本与隐性池文库，PCR并高通量测序；按直接组装方式，初步构建两亲本与隐性池全基因组，比对两亲本基因组序列，分别获得显性亲本与隐性亲本中的特异片段；进一步分析亲本基因组后，获得特异片段可能的等位关系；将显性亲本中的特有片段与隐性池测序片段对比，获得隐性池中没有出现过的片段，即为候选位点；

(5)目标基因克隆：通过在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，或通过PCR方式检测隐性混合池中每一单株每一候选位点；分析显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因；

(6)克隆基因的功能验证：按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

3.根据权利要求1所述的隐性混合池测序基因克隆方法，其特征在于，所述亲本杂交构建分离群体利用遗传距离近的纯系亲本。