[发明专利]一种隐性混合池测序基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种隐性混合池测序基因克隆方法。

背景技术

自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。

经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(我们称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F₁(基因型YyRr)，F₁自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F₂代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为1％，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距1cM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，仍以上述实例进行说明。以籽粒形状为标准，将F₂群体划分为两个部分(池)：显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F₂各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。

分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下：

(1)经典定位方法依赖于分子标记，分子标记分为两种，一种为通用标记，如RAPD、AFLP等，可用于任何物种，但这些标记在染色体上的位置信息不明确，因此，利用它们定位基因极为耗时耗力且十分困难，利用这类标记定位的基因相当有限。另一类标记是已知染色体信息的，如SSR标记。只要找到了与性状连锁的标记，就相当于找到目标基因的大致位置，目前大部分性状是利用此类标记定位的。然而，已开发此类标记的物种只占了很少一部分，绝大部分自然界的有利基因无法通过这一方法定位、克隆和利用。

(2)找到的是与目标基因连锁的分子标记，即得到的是包含目标基因的区段，而不是目标基因本身，还需要基因预测和大量验证工作以排除区段内非目标基因，当区段较大时，该工作十分困难甚至难以完成。而且易漏掉基因，如很小的蛋白分子、非编码基因等。

(3)要求定位群体遗传距离大，找到连锁标记的可能性才大。从而导致一些问题。第一，过大遗传距离常导致性状偏分离，需另建群体调查性状分离比，增加了工作量。第二，远缘杂交难以用于育种，导致基因定位理论研究与育种应用实践脱节，这违背了基因定位的初衷。

(4)精细定位时，连锁标记与目标基因距离很近，发现多态性标记变得越来越难，常出现无标记可用的情况。另外，相邻很近导致交换很难发生，要获得准确的交换率，群体要求很大。而交换率计算是定量分析，需要检查群体每一个单株，工作量十分巨大。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够准确、快速克隆目标基因的新方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种隐性混合池测序基因克隆方法，包括以下步骤：亲本杂交构建分离群体；按每个个体目标性状的差异对分离群体分池，获得隐性池，通过对亲本全基因组高通量测序、组装与比对获得显性与隐性亲本特异位点，与隐性混合池全基因组测序结果比较获得候选位点；通过PCR检测隐性池中每一基因型候选位点，或通过富集隐性池中候选位点后重测序的方式确定目标位点；PCR扩增克隆目标基因，并通过遗传互补实验验证所克隆基因的功能。