[发明专利]丙二醛修饰蛋白质作为错误折叠蛋白质荧光探剂的应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质或肽的检测领域。具体而言，本发明涉及使用丙二醛对错误折叠蛋白质或肽进行荧光检测。

背景技术

蛋白质是生命功能分子，参与生命活动的方方面面。不同功能的蛋白质具有不同的结构，具有完整一级结构的多肽或蛋白质，只有当其折叠形成正确的三维空间结构才可能具有正常的生物学功能。在某些物理、化学、生物等因素的作用下，蛋白质发生空间构象改变，引起蛋白质分子错误折叠并形成淀粉样沉积。一旦蛋白质形成了错误的空间结构，将丧失其生物学功能，还会引起细胞代谢障碍，甚至疾病的发生。迄今已发现20多种蛋白质的错误折叠与疾病相关。神经退行性疾病与蛋白质的错误折叠和沉积有关(Taylor等，2002)，如阿尔茨海默病(AD)，帕金森病(PD)，亨廷顿舞蹈病，朊蛋白病，家族性肌萎缩侧索硬化症(ALS)等。蛋白质的错误折叠可以发生在细胞内或分布在细胞表面，如Tau、α-synuclein等分布在神经细胞内(以包涵体形式存在的蛋白质错误折叠聚积物)(Kopito，2000)，而amyloidβ(Aβ)分布在神经元和胶质细胞表面(细胞外的淀粉样蛋白质聚积物)(Takahashi等，2002)。这是许多哺乳类动物中枢神经系统机能退行性改变的共同病理特征。因此，探索和阐明神经系统某些特定蛋白质的错误折叠，特别在细胞内的错误折叠以及错误折叠产物导致神经细胞死亡的机制，对神经退行性疾病的药物设计以及防治具有重大的科学意义。

无论在细胞外还是在细胞内沉积的错误折叠蛋白质聚积物都可能引起细胞代谢障碍，甚至细胞死亡。针对诱导蛋白质错误折叠的有关危险因素和相关疾病发病诱因已经有了大量的研究，如氧化应激、自由基、重金属、脂代谢紊乱、自吞噬系统功能失调以及蛋白质的异常化学修饰等等。因为蛋白质错误折叠的重要生理、病理意义，人们越来越重视对蛋白质错误折叠的研究，并取得了许多重要的进展。在对蛋白质错误折叠发生机制的研究中，生物物理学技术以及计算生物学的应用使得科研人员能够系统地分析外界条件改变对蛋白质折叠作用的影响。同时，通过对蛋白质错误折叠动物模型(如过表达Aβ蛋白的AD果蝇模型)的研究(Iijima等，2008)，科研人员能够从个体水平观察到蛋白质错误折叠后一系列的生理病理效应。但是，由于缺少对于错误折叠蛋白的有效标记物，仍有许多问题无法得到解决，如细胞如何对错误折叠的蛋白质进行应答，错误折叠蛋白质如何引起细胞凋亡的机制，组织中错误折叠的蛋白如何引发一系列病理效应等等。要解决蛋白质错误折叠领域这些至关重要的问题，需要一种能够标记错误折叠蛋白的技术手段，即制备一种有效的荧光探剂，能够特异标记蛋白质的错误折叠，通过荧光显微镜直接观察错误折叠蛋白质与细胞的相互作用以及在活细胞内的动态过程，从而对错误折叠蛋白在细胞和组织水平进行观察和研究。

目前，在研究细胞内蛋白质折叠与动态运输所采用的标记物可以分为几类：(1)采用荧光蛋白直接融合标记蛋白质(Chudakov等，2010)，观察被标记的蛋白质在细胞的定位(2008年获得诺贝尔化学奖)。然而，这种标记方法在原有蛋白上融合了一个分子量相对较大的蛋白，在研究蛋白质错误折叠时难以排除融合蛋白对原有蛋白结构的影响。(2)采用得较多的是免疫荧光标记，通过单克隆抗体对细胞内的蛋白质进行标记，进行蛋白质在胞质或胞核内定位(Dinamarca等，2008)。免疫荧光标记所面临的问题是在抗体结合了目的蛋白质前，必须对细胞进行固定，因此这种方法无法用于蛋白质在活细胞内的动态观察。(3)目前最常见用于错误折叠蛋白质荧光标记物是一类小分子有机染料1，8-ANS(1-Anilinonaphthalene-8-Sulfonic Acid，与蛋白质分子间的疏水核结合，Pastukhov等，2003)、ThT(Thioflavin T，与淀粉样蛋白结合，Hudson等，2009)、ThS(Thioflavin S，与细胞内淀粉样蛋白结合，Guntern等，1992)、Rhodamine B(直接标记蛋白质，Kubin等，1982)等等。但是，这些荧光标记物不属于天然生命体内存在的具有诱导蛋白质聚积作用的化合物，用于活细胞的观察也较为困难。