[发明专利]一种阿霉素与膜联蛋白V偶联物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及阿霉素与膜联蛋白V的偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

阿霉素是一种蒽环类抗生素，用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等癌症，抗癌谱比较广。周密等人（Zhou, M.等人，2008，复旦学报*医药版，35:793-798）研究发现阿霉素是通过内源性的caspase-3途径诱导肝癌细胞凋亡。阿霉素对正常细胞也发生作用，造成很大的毒副作用，主要表现为心肌毒性、骨髓抑制和神经毒性。阿霉素对心肌组织的亲和力明显高于其他组织，造成心肌毒性。由于阿霉素对于肿瘤靶向性差、因此药物的副作用大。如何提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性成为阿霉素临床应用的一个重大难题。

膜联蛋白V是一种人体内源性蛋白，属于Ca ^2 +依赖性磷脂结合蛋白家族，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合，它具有抗凝及抗炎的作用。近年来还发现膜联蛋白V具有抗肿瘤的作用。在肿瘤生长的过程中，肿瘤细胞会产生表面富含磷脂酰丝氨酸的微泡，微泡中含有可以促进肿瘤血管新生的表皮生长因子受体等物质。膜联蛋白V通过阻止这些微泡与肿瘤血管上皮细胞的融合，从而抑制了肿瘤血管新生和肿瘤的生长。膜联蛋白V蛋白在体内可以与带有外翻的磷脂酰丝氨酸的肿瘤细胞结合。

发明内容

为了提高阿霉素对于肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤活性，本发明的目的在于提供一种提高阿霉素抗肿瘤活性的方法及其制备方法，以及在制备抗肿瘤药物上的应用。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一种膜联蛋白V与阿霉素的偶联物，其中膜联蛋白V是指具有与磷脂酰丝氨酸结合能力的野生型膜联蛋白V及其突变体或者截短体分子。

上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的制备方法，可以通过下述步骤进行：

（1）膜联蛋白V活化： 将膜联蛋白V溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺酸基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），EDC能够将含有羧基的分子和含有氨基的分子偶联，加入不同浓度Sulfo-NHS用以增强偶联效果。

（2）活化反应中止： 加入2-巯基乙醇中和未反应的EDC。

（3）浓缩中间产物： 用截留分子量为10KD的超滤管离心浓缩中间产物溶液。

（4）偶联反应： 将盐酸阿霉素饱和溶液与浓缩后的膜联蛋白V活化中间产物混合，室温搅拌反应。反应后，体系中产生偶联物的絮状沉淀。

（5）膜联蛋白V-阿霉素偶联物的溶解与纯化： 用含8M尿素的溶液溶解反应体系中产生的偶联物絮状沉淀，然后用0.1 M磷酸钠溶液稀释产物溶液，并反复进行浓缩和重复稀释过程，直至滤过液中检测不到游离阿霉素为止。

上述膜联蛋白V与阿霉素偶联物的检测方法，可以通过下述步骤进行：

偶联物中的膜联蛋白V的浓度使用Bradford法测定蛋白质含量，偶联物中的阿霉素含量使用紫外吸光光度法测量，根据朗伯-比尔公式计算。将偶联物、膜联蛋白V、阿霉素和滤过液分别进行紫外-可见吸收光谱分析，扫描范围为190～700 nm。

上述制备的偶联物可以用以制备抗肿瘤药物。