[发明专利]银鲳精子冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明属于精子冷冻技术领域，具体涉及一种银鲳精子冷冻保存方法。

背景技术

银鲳属于鲈形目、鲳亚目、鲳科、鲳属，肉质洁白、细嫩、少刺，富含蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、钠、钾、维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酸等营养素，经常食用能强身健体、预防心肌梗塞、脑血栓等成人疾病，因而倍受养殖业者和消费者的喜爱，市场开发前景广阔。然而由于过度捕捞和环境污染，银鲳资源严重衰退，不能满足广大消费者的需求，开展银鲳的人工繁育技术研究并提供优质苗种为最佳选择。从目前来看，银鲳的人工繁殖采用海上人工受精，需要雌雄同步成熟，天然条件下银鲳雄鱼的发育快于雌鱼，这样必然影响到人工繁殖技术的成功及受精率。因此进行银鲳精子冷冻保存，不但可提高银鲳人工繁殖过程中的受精率，而且还有利于银鲳的种质资源的保护。

关于海水鱼类的精子冷冻保存方法，已公开的专利有“紫红笛鲷精子冷冻保存方法”、“条斑星鲽精子冷冻保存方法”和“圆斑星鲽精子冷冻保存方法”。但不同鱼类精子的冷冻保存方法会由于种类、生活环境的不同而不同，所以本申请人在经过精心实验研究的基础上，提出了本项专利申请技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种受精率高的银鲳精子冷冻保存方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种银鲳精子冷冻保存方法，保存方法的步骤是：

(1)精液采集：选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，采用腹部挤压法获取精液，将活动率85％以上的精液用于精子冷冻，精液采集后置于冰上保存；

(2)基础液选择：配制方法：NaCl7.5g/L，NaHCO₃0.25g/L，KCl0.38g/L，CaCl₂·2H₂O0.18g/L，MgCl₂0.22g/L，NaH₂PO₄0.22g/L，D-葡萄糖1g/L，以1N HCl调节pH至7.3，备用；

(3)抗冻剂选择：将上述基础液终浓度的10-15％二甲基亚砜作为抗冻保护剂；

(4)精子的稀释与平衡：将精液与抗冻剂按照体积比1∶1混合，在冰上平衡4-5min；

(5)精子冷冻：将平衡后的精液分装入冻存管中，降温冷冻保存；

(6)精子解冻：先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留1.5-2.5min，然后将冷冻管取出迅速置于25-30℃水浴中解冻80-100s，取出置于室温下至完全融化；

(7)精子激活后的活力检验：室温条件下，以自然海水激活精子，检查精子活力，统计精子快速运动时间。

而且，所述步骤(5)中的精子降温冷冻保存采用三步降温法，即液氮罐颈部-20℃停留3min，液氮面上5cm处-150℃停留5min，再直接投入液氮中保存。

本发明的优点和积极效果是：

本发明选取性成熟的亲鱼采集优质精液，选择适宜基础液及抗冻液，精液与抗冻液按照体积比1∶1混合后，冰上保存4-5min，按照三步降温法降温至-150℃后停留5min，直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻管在液氮蒸汽中停留2min，迅速投入28℃水浴解冻90s后置于室温下完全溶解，将解冻精液用海水激活，精子的快速游动时间平均57.41s，精子活力(快速运动精子占全部精子的百分数)平均为83.62％，极大提高了银鲳的受精率。

具体实施方式

以下结合具体实施方法来进一步说明本发明；需要强调的是：对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

一种银鲳精子冷冻保存方法，步骤是：

(1)精液采集：

选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，采用腹部挤压法获取精液，5ml离心管收集精液，活动率85％以上的精液用于精子冷冻，精液采集后置于冰上保存；

(2)基础液选择：

基础液选择：配制方法：NaCl7.5g/L，NaHCO₃0.25g/L，KCl0.38g/L，CaCl₂·2H₂O0.18g/L，MgCl₂0.22g/L，NaH₂PO₄0.22g/L，D-葡萄糖1g/L，以1N HCl调节pH至7.3，备用；

(3)抗冻剂选择：

以基础液终浓度的13％DMSO(二甲基亚砜)作为抗冻保护剂；