[发明专利]一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法

权利要求书

1.一种筛选牛核移植供体细胞的方法，其特征在于以下步骤：

1)剪取牛耳尖端4-5cm²的组织，利用接种法培养得到牛耳组织成纤维细胞；

2)在步骤1)的细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力，即MTT OD值；

3)挑选细胞活力OD值为0.609±0.053的第六代的细胞，备用；

4)用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理步骤所得的细胞24h的细胞作为供体细胞；

5)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养至成熟，备用；

6)将步骤5)的牛卵母细胞作为受体，进行核移植，观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率；

其中：

上述试剂的组分及配制方法如下

细胞培养液-1和细胞培养液-2；

细胞培养液-1：胎牛血清10ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml；

细胞培养液-2：胎牛血清20ml，青霉素-链霉素抗菌液1ml，用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml；

抗氧化剂培养液：向细胞培养液-1中添加β-巯基乙醇，其浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、和150μmol/L，过滤除菌，4℃下保存；

成熟培养液：TCM199 26ml；胎牛血清3.0ml；促卵泡激素15μg；促黄体素150ng；雌二醇30μg；表皮生长因子150ng；丙酮酸钠6.6mg；青霉素-链霉素抗菌液0.3ml；过滤灭菌，4℃下保存；

胚胎培养液：肌醇0.015g；必须氨基酸900μl；非必需氨基酸300μl；牛血清白蛋白0.09g；青霉素-链霉素抗菌液300μl；丙酮酸盐600μl；Stock G30μl；Stock C28ml；过滤灭菌，4℃下保存；

各种盐溶液的配制：

Stock A：NaCl1.267g；KCl0.107g；KH₂PO₄0.032g；MgSO₄·7H₂O0.036g；青霉素-链霉素抗菌液0.2ml；Na-Lactate0.12ml；H₂O19.5ml；

Stock B：NaHCO₃0.21g；H₂O10ml；

Stock D：CaCl₂·2H₂O0.262g；H₂O10ml；

Stock G：L-Glucose0.292g；H₂O10ml；

Stock C：STOCK A1.1ml；STOCK B1.0ml；STOCK D0.1ml；H₂O7.9ml。